Biosuperfici per lo studio del fattore di forma e dell'orientamento spaziale di biomolecole tramite Microscopia a Forza Atomica

Molte funzioni cruciali per la vita cellulare sono strettamente connesse alla struttura delle biomolecole coinvolte. Ciò spiega l’accresciuto interesse in questi ultimi anni per la comprensione della correlazione tra struttura e funzione di una biomolecola. In queste indagini sono coinvolte differenti metodiche analitiche, che spaziano dalla cristallografia a raggi X all’NMR, alle tecniche di microscopia elettronica SEM e TEM. In molti casi, però, per comprendere alcune proprietà ed alcuni aspetti della funzione di una biomolecola può essere sufficiente conoscerne il fattore di forma e le dimensioni, e non necessariamente la sua struttura atomica dettagliata. La Microscopia a Forza Atomica (AFM) consente di ottenere immagini tridimensionali di biomolecole in ambiente fisiologico, coniugando rapidità d’indagine a semplicità di preparazione del campione. Tale metodica consente di ottenere “bioimmagini”, cioè visualizzazioni dirette della forma, delle dimensioni, della disposizione e dell’orientamento spaziale di molecole d’interesse biologico. Questa prerogativa non è esclusiva dell’AFM, ma questa è l’unica microscopia che permette di operare senza modifiche irreversibili del campione, in ambiente fisiologico, in tempi brevi e con estrema sensibilità. Buone immagini AFM possono essere ottenute solo se la biomolecola è opportunamente ancorata ad una superficie piana. L’immobilizzazione di biomolecole su superfici è un’area di ricerca molto attiva: le strategie perseguite prevedono in genere l’introduzione di gruppi reattivi sulla superficie stessa in grado di formare legami covalenti con la biomolecola. Infatti, l’adsorbimento fisico delle biomolecole alla superficie, pur se facilmente realizzabile, non è un processo controllabile e porta facilmente alla denaturazione delle biomolecole stesse per interazione col supporto; ad esso quindi si preferisce un legame specifico biomolecola–superficie, che sia stabile nel tempo, che garantisca il mantenimento della conformazione molecolare e che sia controllabile modulando le condizioni di reazione. L’ottenimento di adeguate “biosuperfici”, cioè di supporti estremamente piatti e chimicamente suscettibili all’interazione con specifiche biomolecole, costituisce un problema biotecnologico che si configura come il prerequisito fondamentale per lo studio mediante AFM delle caratteristiche strutturali e morfologiche delle molecole biologiche stesse. A tal fine è stato depositato un film sottile d’oro, mediante la tecnica di gold sputtering, su supporti di vetro silanizzato. Lo spessore dello strato metallico depositato in funzione del tempo di sputtering è stato verificato tramite AFM, mentre la stabilità dello strato d’oro nelle condizioni sperimentali normalmente impiegate per l’immobilizzazione di biomolecole è stata confermata tramite indagini con microscopia ottica. Su questi supporti sono stati quindi costruiti dei self assembling monolayers (SAMs) di tioli organici, contenenti gruppi S-H o S-S, su cui immobilizzare in modo controllato e specifico delle biomolecole. La versatilità di tali SAMs come biosuperfici è da ricondurre alla possibilità di creare monostrati autoassemblanti misti, cioè a due o più componenti, in cui almeno uno dei componenti contenga un gruppo funzionale utilizzabile per promuovere interazioni specifiche con biomolecole presenti in soluzione. Come componente caratterizzante della biosuperficie è stata utilizzata la biotina, una piccola molecola organica del peso pari a 244 Dalton che, inserita tramite legame covalente in una molecola biologicamente attiva, non ne altera l’attività biologica. Sono stati preparati SAMs misti di acido 3-mercapto-proprionico e di una biotina modificata contenente un gruppo S-S, a diversi rapporti di concentrazione relativa per ottenere una biosuperficie con un numero controllato di molecole di biotina, cioè di siti di ancoraggio specifici per l’immobilizzazione successiva della Streptavidina. Successivamente si è verificata la formazione del complesso biotina–streptavidina, complesso comunemente utilizzato in biochimica ed in molti ambiti immunodiagnostici per la sua elevata specificità e stabilità in diverse condizioni sperimentali. Utilizzando soluzioni a concentrazione variabile di streptavidina è stato dimostrato come il numero di molecole di proteina fissate alla biosuperficie dipenda direttamente dal numero di molecole di biotina inserite nel SAM misto. Il supporto così ottenuto, costituito da superfici silanizzate e dorate ed attivate mediante l’impiego di SAMs a reattività “controllata”, può essere proficuamente impiegato per l’immobilizzazione di biomolecole che possono essere visualizzate tramite la Microscopia a Forza Atomica a livello di singola molecola.