Sviluppi di un clone infettante di Metapneumovirus aviare codificante la proteina GFP (Green Fluorescent Protein)

Metapneumovirus aviare (AMPV) è causa nel tacchino di una delle principali patologie di questa specie nota come Rinotracheite del Tacchino (TRT). Per la profilassi della TRT sono disponibili in commercio da oltre 15 anni vaccini vivi attenuati con metodi tradizionali, che hanno portato ad un netto miglioramento del controllo della malattia. Tuttavia ancora rimangono dubbi sulle performance di tali vaccini specie in condizioni di campo. Si è osservata ad esempio la tendenza a riacquisire patogenicità e tale fenomeno sembra essere la diretta conseguenza di mutazioni genetiche anche minime. Recentemente è stato messo a punto un sistema di reverse genetics per AMPV sottotipo A, che permette di introdurre in punti specifici del genoma mutazioni o delezioni, di ottenere cloni infettanti con i cambiamenti apportati e di valutarne le conseguenze fenotipiche. Tale sistema fornisce uno strumento fondamentale per indagare le basi molecolari della patogenicità, e più in generale per studiare la biologia del virus. Questo lavoro descrive l’utilizzo del sistema di reverse genetics per generare un AMPV-A ricombinante che esprima la proteina fluorescente GFP (Green Fluorescent Protein). In cDNA circolarizzato derivato da AMPV-A è stato inserito un sito di restizione mediante mutagenesi sito-specifica. Dopo taglio enzimatico è stato inserito in tale plasmide il gene che codifica per GFP. L’avvenuta ligazione, dopo trasformazione batterica, è stata verificata mediante screening delle singole colonie con specifiche PCR e successivo sequenziamento. Copie del plasmide purificato sono state trasfettate in cellule VERO con l’aggiunta di plasmidi di supporto che codificano per il complesso delle proteine ribonucleari (RNP). L’espressione della GFP è stata confermata mediante osservazione di fluorescenza al microscopio UV. Inoltre i risultati ottenuti mostrano come AMPV-A può essere manipolato geneticamente, grazie al sistema di reverse genetics, per esprimere stabilmente proteine estranee, mostrando un grosso potenziale di utilizzo quale vaccino vettore di proteine virali appartenenti a virus patogeni per i volatili o i mammiferi. Inoltre la disponibilità di AMPV-A esprimente la proteina fluorescente GFP potrà essere utile per studi di tropismo e patogenesi.