Il 6beta-idrossicortisolo (6betaOH-F) nell’uomo e in molti animali tra cui il bovino, è uno dei metaboliti del cortisolo (F) prodotti a livello epatico. Il 6betaOH-F è escreto nelle urine in forma non coniugata e rappresenta l’1% del totale dei metaboliti del cortisolo nell’uomo (Galteau et al., 2003). Ged et al. (1989) furono i primi a dimostrare che la trasformazione del cortisolo in 6betaOH-F è catalizzata dal CYP3A e quindi il monitoraggio della sua concentrazione urinaria può essere utilizzato come marker in vivo dell’induzione e dell’inibizione delle isoforme CYP3A (Galteau et al., 2003). L’urina è una matrice molto complessa, la cui composizione, le proprietà chimico-fisiche ed anche le concentrazioni di biomarcatori fisiologici possono essere influenzate nella stessa specie bovina da fattori quali l’alimentazione, l’età e le condizioni di stabulazione ed anche eventuali trattamenti farmacologici. L’urina è una matrice che può essere facilmente raccolta in allevamento, senza causare situazioni stressanti per gli animali, e congelata può essere conservata per tempi relativamente lunghi. I meccanismi che regolano la liberazione di F endogeno sono molto articolati. Le modalità di regolazioni caratteristiche dell’asse ipotalamo – ipofisi - surrene (HPA) sono tre: - il ritmo circadiano della steroidogenesi basale; - l’incremento della steroidogenesi in risposta allo stress (Schimmer et al., 2006). - la regolazione a feedback negativo da parte dei corticosteroidi surrenalici. Quindi le variazioni di cortisolo e del suo metabolita possono dare delle indicazioni di eventuali trattamenti con corticosteroidi. Inoltre una volta valutate separatamente le concentrazioni di F e del suo metabolita 6betaOH-F il rapporto tra 6betaOH-F e cortisolo permette di normalizzare eventuali differenze di produzione di 6betaOH-F dovute alle variazioni del ritmo circadiano e alla variabilità individuale (Ohno et al., 2000). Nella prima fase del lavoro i campioni di urina raccolti dai vitelli appartenenti ai diversi gruppi sperimentali sono stati analizzati al fine di determinare la concentrazione urinaria di cortisolo (F) e 6beta-idrossicortisolo (6betaOH-F) utilizzando un metodo RIA e un metodo ELISA, rispettivamente. Prima di passare all’esecuzione delle indagini sui vari gruppi sottoposti a trattamenti è stato necessario procedere alla validazione dei due metodi utilizzati (RIA e ELISA) con urine di vitelli prelevati da animali controllo quindi non trattate e filtrate su carbone attivo per valutare adeguatamente le performance dei metodi applicati utilizzando il protocollo messo a punto da Simontacchi et al. (1997). Il pattern di escrezione urinaria del cortisolo e del suo metabolita negli animali trattati sperimentalmente con desametazone, identificato attraverso l’utilizzo dei test di screening RIA ed ELISA, è stato successivamente confermato mediante analisi in spettrometria di massa (LC-MS/MS). La concordanza dei risultati ha dimostrato che cortisolo e 6beta-idrossicortisolo possono essere considerati efficaci marcatori di trattamento illecito con desametazone. Infatti l’effetto della loro ridotta escrezione nelle urine è più duraturo della eliminazione di desametazone somministrato, quindi rappresenta un valido supporto nell’indagine preliminare per la valutazione dei trattamenti illeciti in allevamento. In particolare il contenuto urinario di cortisolo, è risultato il parametro caratterizzato da maggior capacità discriminante; la sua valutazione mediante test RIA consente di eseguire piani di sorveglianza conoscitivi in allevamento, su larga scala con costi contenuti

Valutazione del rischio di trattamenti illeciti nel bovino da carne con desametasone mediante l’impiego di cortisolo e 6beta-idrossicortisolo in campioni di urina

GALLINA, GUGLIELMO;CAPOLONGO, FRANCESCA;MONTESISSA, CLARA
2011

Abstract

Il 6beta-idrossicortisolo (6betaOH-F) nell’uomo e in molti animali tra cui il bovino, è uno dei metaboliti del cortisolo (F) prodotti a livello epatico. Il 6betaOH-F è escreto nelle urine in forma non coniugata e rappresenta l’1% del totale dei metaboliti del cortisolo nell’uomo (Galteau et al., 2003). Ged et al. (1989) furono i primi a dimostrare che la trasformazione del cortisolo in 6betaOH-F è catalizzata dal CYP3A e quindi il monitoraggio della sua concentrazione urinaria può essere utilizzato come marker in vivo dell’induzione e dell’inibizione delle isoforme CYP3A (Galteau et al., 2003). L’urina è una matrice molto complessa, la cui composizione, le proprietà chimico-fisiche ed anche le concentrazioni di biomarcatori fisiologici possono essere influenzate nella stessa specie bovina da fattori quali l’alimentazione, l’età e le condizioni di stabulazione ed anche eventuali trattamenti farmacologici. L’urina è una matrice che può essere facilmente raccolta in allevamento, senza causare situazioni stressanti per gli animali, e congelata può essere conservata per tempi relativamente lunghi. I meccanismi che regolano la liberazione di F endogeno sono molto articolati. Le modalità di regolazioni caratteristiche dell’asse ipotalamo – ipofisi - surrene (HPA) sono tre: - il ritmo circadiano della steroidogenesi basale; - l’incremento della steroidogenesi in risposta allo stress (Schimmer et al., 2006). - la regolazione a feedback negativo da parte dei corticosteroidi surrenalici. Quindi le variazioni di cortisolo e del suo metabolita possono dare delle indicazioni di eventuali trattamenti con corticosteroidi. Inoltre una volta valutate separatamente le concentrazioni di F e del suo metabolita 6betaOH-F il rapporto tra 6betaOH-F e cortisolo permette di normalizzare eventuali differenze di produzione di 6betaOH-F dovute alle variazioni del ritmo circadiano e alla variabilità individuale (Ohno et al., 2000). Nella prima fase del lavoro i campioni di urina raccolti dai vitelli appartenenti ai diversi gruppi sperimentali sono stati analizzati al fine di determinare la concentrazione urinaria di cortisolo (F) e 6beta-idrossicortisolo (6betaOH-F) utilizzando un metodo RIA e un metodo ELISA, rispettivamente. Prima di passare all’esecuzione delle indagini sui vari gruppi sottoposti a trattamenti è stato necessario procedere alla validazione dei due metodi utilizzati (RIA e ELISA) con urine di vitelli prelevati da animali controllo quindi non trattate e filtrate su carbone attivo per valutare adeguatamente le performance dei metodi applicati utilizzando il protocollo messo a punto da Simontacchi et al. (1997). Il pattern di escrezione urinaria del cortisolo e del suo metabolita negli animali trattati sperimentalmente con desametazone, identificato attraverso l’utilizzo dei test di screening RIA ed ELISA, è stato successivamente confermato mediante analisi in spettrometria di massa (LC-MS/MS). La concordanza dei risultati ha dimostrato che cortisolo e 6beta-idrossicortisolo possono essere considerati efficaci marcatori di trattamento illecito con desametazone. Infatti l’effetto della loro ridotta escrezione nelle urine è più duraturo della eliminazione di desametazone somministrato, quindi rappresenta un valido supporto nell’indagine preliminare per la valutazione dei trattamenti illeciti in allevamento. In particolare il contenuto urinario di cortisolo, è risultato il parametro caratterizzato da maggior capacità discriminante; la sua valutazione mediante test RIA consente di eseguire piani di sorveglianza conoscitivi in allevamento, su larga scala con costi contenuti
2011
Atti della giornata di divulgazione scientifica relativa al Progetto di ricerca “ Contaminanti chimici e biologici nelle derrate alimentari: valutazione del rischio e strategie di prevenzione in allevamento”
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