PLANT FOOD ALLERGENS: PURIFICATION AND CHARACTERISATION OF THE Ses I 2 MAJOR ALLERGEN FROM SESAMUM INDICUM; STRUCTURE-STABILITY-ALLERGENICITY RELATIONSHIPS OF NATIVE AND METHIONINE-OXIDISED SPECIES

In questo lavoro, abbiamo purificato in quantità sufficiente (10-30 mg) l’allergene maggiore da semi di sesamo (S. indicum) Ses i 2 per successivi studi strutturali e conformazionali. Ses i 2 rappresenta un modello adeguato per investigare le caratteristiche strutturali e conformazionali associate agli allergeni alimentari. Sulla base dei dati ottenuti è stato possibile ricavare un modello per omologia di Ses i 2 che mostra la tipica struttura delle 2S albumine con quattro segmenti alpha-elicoidali a formare un core idrofobico compatto organizzato in una architettura up-and-down. La struttura globulare di Ses i 2 è stabilizzata da cinque ponti disolfuro, in particolare otto residui di Cys sono conservati nella famiglia delle prolamine. Ses i 2 mostra, inoltre una straordinaria stabilità verso la denaturazione chimica e termica, associata a una forte resistenza alla proteolisi dei principali enzimi gastrointestinali, lisosomiali, di matrice e della coagulazione. Queste osservazioni permettono di ipotizzare un assorbimento della proteina in forma intatta a livello intestinale. Alla luce di queste considerazioni la derivatizzazione chimica di Ses i 2 con un label fluorescente come la fluoresceina isotiocianato è stata eseguita con l’intento di esplorare l’internalizzazione cellulare dell’allergene mediante analisi di immunofluorescenza. Per evidenziare l’internalizzazione cellulare, il coniugato Ses i 2-[F] è stato incubato con cellule Caco-2, che in specifiche condizioni formano un mostrato simile all’epitelio intestinale. I dati ottenuti dimostrano che Ses i 2 viene assorbito attraverso un processo endocitotico e questa informazione associata alla resistenza agli enzimi lisosomiali permette di ipotizzare una interazione di Ses i 2 in forma intatta con le cellule dendritiche nella lamina propria. In questo lavoro abbiamo anche studiato l’effetto dell’ossidazione dei 9 residui di metionina presenti nella sequenza di Ses-i-2 sulla sua conformazione, stabilità e proprietà antigeniche, dove l’osidazione è stata indotta con mieloperossidasi leucocitaria. I nostri risultati indicano che l’ossidazione selettiva delle metionine induce un’alterazione della conformazione di Ses-i-2 ed una drammatica diminuzione della stabilità conformazionale. Sorprendentemente, Ses i 2 induce un forte produzione di IL-10 con una diminuzione nell’espressione di Il-12p70, la più importante citochina nello sviluppo della risposta leucocitaria di tipo Th1. Al contrario, Ses i 2-ox non è in grado di aumentare l’espressione di IL-10 e questo è correlato con la forte induzione nella produzione di IL-12p70 da parte delle DCs. Ses i 2 e Ses i 2-ox hanno dimostrato un scarsa capacità di stimolare l’espressione delle molecole co-stimolatorie CD80 e CD86, mentre HLA è aumentato in presenza di Ses i 2-ox. Nell’insieme questi dati suggeriscono che Ses i 2 non è in grado di indurre una risposta Th1, mentre Ses i 2-ox, stimolando la produzione di IL-12p70 e l’espressione di HLA è capace di indurre una risposta Th1-self. Questi risultati sostengono l’ipotesi che il danno ossidativo e la processazione proteolitica di una antigene siano fortemente correlati nel determinarne l’immunogenicità.