MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO DI REAL-TIME PCR PER LA DIAGNOSI E LA DIFFERENZIAZIONE DI METAPNEUMOVIRUS AVIARE SOTTOTIPO A E B

I metapneumovirus Aviari (aMPV) sono virus ad RNA appartenenti alla famiglia delle Paramyxoviridae, genere Metapneumovirus. Sono causa nel tacchino di un’infezione delle prime vie respiratorie nota come Rinotracheite del Tacchino (TRT), mentre nel pollo sono responsabili di forme respiratorie più o meno gravi, che possono sfociare nella Sindrome della Testa Gonfia (SHS). Sono stati sino ad ora individuati 4 sottotipi di aMPV (A, B, C e D). La presenza di manifestazioni cliniche, non patognomoniche per infezione da aMPV, la scarsa capacità di replicazione del virus nell'organismo ospite e la sua capacità di causare infezioni subcliniche, nonchè la sua variabilità genetica, rendono necessari metodi diagnostici molto accurati e sensibili. La biologia molecolare offre un'alternativa veloce, sensibile, specifica e pratica per la diagnosi delle infezioni sostenute da aMPV. Per questa ragione nel corso degli anni sono stati messi a punto diversi protocolli di RT-PCR. Più recentemente, particolare attenzione è stata rivolta allo sviluppo di metodiche basate sull’uso di real-time RT-PCR. I protocolli finora sviluppati prevedono l’utilizzo di sonde oligonucleotidiche specifiche marcate con fluorofori. Tuttavia questo approccio comporta un rilevante costo iniziale, una più complessa ottimizzazione della metodica ed una spiccata suscettibilità alla variabilità genomica nella regione target. A partire da questi presupposti, al fine di rilevare, quantificare e genotipizzare i due sottotipi di aMPV più diffusi (i.e. sottotipo A e B), si è scelto di mettere a punto e validare una real-time RT-PCR, avente come target il gene SH, basata sull’uso del SYBR Green I. La metodica ha dimostrato una sensibilità analitica paragonabile a quella di altri test riportati in bibliografia essendo in grado di rilevare, per entrambi i sottotipi, titoli virali dell’ordine di 0.5 TCID50/mL. L’elevata efficienza di reazione (efficienza~90%) e la linearità nella relazione fra titoli virali e Crossing point (Cp) riscontrati, rendono inoltre la metodica adatta anche alla quantificazione virale. L’ottimizzazione delle condizioni di reazione e l’analisi della curva di melting permettono contestualmente di garantire una elevata specificità del test (assenza di cross-reazioni con altri comuni patogeni aviari) e la discriminazione dei due sottotipi, le cui Temperature di melting (Tm) si sono rivelate caratteristiche (Tm media per aMPV-A=82,72 e per aMPV-B=81,94) e altamente ripetibili nelle diverse prove fatte in corso di validazione. Complessivamente queste caratteristiche rendono il nostro protocollo di real-time RT-PCR un test sensibile, specifico e rapido, utilizzabile per la contestuale diagnosi, quantificazione e genotipizzazione dei sottotipi di aMPV più diffusi a livello mondiale.