La leucemia mieloide cronica (CML) è una malattia mieloproliferativa delle cellule ematopoietiche staminali, caratterizzata da un’espansione clonale di cellule staminali pluripotenti progenitrici con il conseguente incremento dei granulociti nel sangue. Un marcatore della CML è il cromosoma Philadelphia (Ph+), originato dalla traslocazione reciproca t(9;22)(q34;q11), che dà origine al gene di fusione BCR/ABL1, codificante per l’oncoproteina Bcr/Abl, una tirosin-chinasi costitutivamente attiva. L’imatinib (STI-571) colpisce selettivamente l’oncoproteina Bcr/Abl e rappresenta la terapia standard d’inizio per questa patologia. Nonostante la sua grande efficacia, la resistenza all’imatinib è emersa come un significativo problema clinico. La linea cellulare LAMA84 è un modello della CML. In questa tesi, abbiamo usato due varianti di cellule LAMA84: una è incapace di sopravvivere e crescere in presenza di imatinib (LAMA84-S), mentre l’altra può crescere in presenza di 1,5 μM imatinib (LAMA84-R). Lo scopo di questo lavoro è stato l’analisi della proteinchinasi CK2 nelle cellule LAMA84-S/R. La proteinchinasi CK2 è un Ser/Thr-chinasi ubiquitaria e costitutivamente attiva, che fosforila svariati substrati implicati in processi chiave della vita cellulare. CK2 presenta generalmente una struttura eterotetramerica composta da due subunità catalitiche  (44 kDa) e/o  (38 kDa) e due subunità regolatrici  (25 kDa). L’analisi mediante western blot dei livelli proteici di Bcr/Abl in diversi lisati cellulari di cellule LAMA84-S e LAMA84-R mostra che la resistenza all’imatinib in queste cellule è associata all’amplificazione del gene BCR/ABL1 e alla sovraespressione di Bcr/Abl. Inoltre, l’analisi dei livelli proteici intracellulari di CK2 evidenzia, inaspettatamente, un’espressione della chinasi di circa due volte maggiore nelle cellule resistenti all’imatinib rispetto a quelle sensibili. Entrambe le subunità CK2 e CK2, ma non CK2’, sono sovraespresse. L’attività dell’oloenzima CK2 è stata saggiata sul substrato -caseina o sul peptide specifico sintetico R3AD2SD5, mentre quella di CK2 monomerica è stata rilevata mediante un in-gel kinase assay. Coerentemente con il livello proteico di CK2, l’attività sia dell’oloenzima che di CK2 monomerica è maggiore nelle cellule LAMA84-R rispetto alle cellule LAMA84-S. L’immunoprecipitazione di Bcr/Abl da lisati cellulari di cellule LAMA84-S/R mostra che CK2 immunoprecipita con Bcr/abl solo nelle cellule resistenti all’imatinib. Questo dato è supportato anche dalla presenza di Bcr/Abl negli immunoprecipitati di CK2 ottenuti dai medesimi lisati e analizzati mediante western blot e spettrometria di massa. Dato che la relazione fra CK2e Bcr/Abl suggerisce una potenziale fosforilazione di CK2 da parte della tirosin-chinasi, si è realizzata un’immunoprecipitazione con l’anticorpo anti-fosfo-tirosina (p-Tyr) da lisati di cellule LAMA84-S/R e l’analisi tramite western blot degli immunoprecipitati rileva la presenza di CK2 solo nei campioni delle LAMA84-R. La Tyr-fosforilazione di CK2aumenta se le cellule sono trattate con l’inibitore delle tirosin-fosfatasi, pervanadato. Per provare se la Tyr-fosforilazione di CK2 è mediata dall’autofosforilazione di CK2, come descritto altrove, o è catalizzata da Bcr/Abl, le cellule LAMA84-R sono state trattate per 24 h con inibitori specifici per CK2 o Bcr/Abl. CK2è stata immunoprecipitata dalle cellule trattate ed è stata analizzato il suo stato di Tyr-fosforilazione mediante western blot. Mentre il CX-4945, un inibitore selettivo per CK2, ora in fase I degli studi clinici su pazienti con tumori solidi, non ha effetto sulla p-Tyr-CK2l’imatinib riduce la Tyr-fosforilazione di CK2, suggerendo che Bcr/Abl è maggiormente coinvolto nella fosforilazione tirosinica di CK2nelle cellule LAMA84-R. Per esaminare il potenziale effetto di CK2 e Bcr/Abl nell’interazione delle due chinasi, le cellule LAMA84-R sono state trattate con il CX-4945, l’imatinib, l’inibitore allosterico di Abl GNF-2, e il potente inibitore chinasico non-specifico staurosporina. Solo il trattamento con l’inibitore di CK2, CX-4945, riduce l’interazione fra le due chinasi. Per sottolineare il ruolo di CK2 durante la proliferazione cellulare, le cellule LAMA84-S/R sono state trattate per 48 h con differenti concentrazioni di CX-4945 e la vitalità cellulare di entrambe le cellule LAMA84-S e LAMA84-R è stata misurata mediante il saggio MTT. I dati suggeriscono che la viabilità di entrambe le linee cellulari decresce all’aumentare della concentrazione del CX-4945, con un maggior effetto dell’inibitore nelle cellule LAMA84-R. Esperimenti effettuati mediante la combinazione di CX-4945 e imatinib, dimostrano che mentre la vitalità delle cellule LAMA84-S trattate con l’imatinib da solo o in combinazione con il CX-4945 è ridotta in modo simile, l’inibizione dell’attività di CK2 da parte del CX-4945 sensibilizza le cellule LAMA84-R a basse concentrazioni di imatinib. Infine, la possibile interazione fra CK2 e altre proteine è stata analizzata nelle cellule resistenti all’imatinib. A questo proposito, CK2 è stata immunoprecipitata da lisati di cellule LAMA84-R e la sua attività CK2 negli immunocomplessi è stata valutata mediante un saggio chinasico in presenza di [33P]ATP. L’analisi mediante SDS/PAGE dei campioni reattivi evidenzia una banda, di circa 35-38 kDa, 33P-fosforilata in modo comparabile alla banda corrispondente alla subunità CK2 autofosforilata. L’analisi di spettrometria di massa ha dimostrato che la banda corrisponde alla subunità j del fattore eucariotico 3 d’inizio della traduzione (eIF3j) e il sito di fosforilazione è stato identificato nella Ser127 (Q-E-E-S-D-L-E). L’analisi di spettrometria di massa degli immunoprecipitati di CK2 ha messo in evidenza la presenza di altre subunità di eIF3: b, f, l, g, h, k. Gli immunoprecipitati di eIF3b ottenuti da lisati di cellule LAMA84-R contengono sia CK2cheCK2 e la fosforilazione in vitro degli immunoprecipitati di eIF3b in presenza di [33P]ATP ha dimostrato che anche eIF3b è un substrato di CK2.

Coinvolgimento della proteinchinasi CK2 nella resistenza all’imatinib in cellule di leucemia mieloide cronica

BORGO, CHRISTIAN
2011

Abstract

La leucemia mieloide cronica (CML) è una malattia mieloproliferativa delle cellule ematopoietiche staminali, caratterizzata da un’espansione clonale di cellule staminali pluripotenti progenitrici con il conseguente incremento dei granulociti nel sangue. Un marcatore della CML è il cromosoma Philadelphia (Ph+), originato dalla traslocazione reciproca t(9;22)(q34;q11), che dà origine al gene di fusione BCR/ABL1, codificante per l’oncoproteina Bcr/Abl, una tirosin-chinasi costitutivamente attiva. L’imatinib (STI-571) colpisce selettivamente l’oncoproteina Bcr/Abl e rappresenta la terapia standard d’inizio per questa patologia. Nonostante la sua grande efficacia, la resistenza all’imatinib è emersa come un significativo problema clinico. La linea cellulare LAMA84 è un modello della CML. In questa tesi, abbiamo usato due varianti di cellule LAMA84: una è incapace di sopravvivere e crescere in presenza di imatinib (LAMA84-S), mentre l’altra può crescere in presenza di 1,5 μM imatinib (LAMA84-R). Lo scopo di questo lavoro è stato l’analisi della proteinchinasi CK2 nelle cellule LAMA84-S/R. La proteinchinasi CK2 è un Ser/Thr-chinasi ubiquitaria e costitutivamente attiva, che fosforila svariati substrati implicati in processi chiave della vita cellulare. CK2 presenta generalmente una struttura eterotetramerica composta da due subunità catalitiche  (44 kDa) e/o  (38 kDa) e due subunità regolatrici  (25 kDa). L’analisi mediante western blot dei livelli proteici di Bcr/Abl in diversi lisati cellulari di cellule LAMA84-S e LAMA84-R mostra che la resistenza all’imatinib in queste cellule è associata all’amplificazione del gene BCR/ABL1 e alla sovraespressione di Bcr/Abl. Inoltre, l’analisi dei livelli proteici intracellulari di CK2 evidenzia, inaspettatamente, un’espressione della chinasi di circa due volte maggiore nelle cellule resistenti all’imatinib rispetto a quelle sensibili. Entrambe le subunità CK2 e CK2, ma non CK2’, sono sovraespresse. L’attività dell’oloenzima CK2 è stata saggiata sul substrato -caseina o sul peptide specifico sintetico R3AD2SD5, mentre quella di CK2 monomerica è stata rilevata mediante un in-gel kinase assay. Coerentemente con il livello proteico di CK2, l’attività sia dell’oloenzima che di CK2 monomerica è maggiore nelle cellule LAMA84-R rispetto alle cellule LAMA84-S. L’immunoprecipitazione di Bcr/Abl da lisati cellulari di cellule LAMA84-S/R mostra che CK2 immunoprecipita con Bcr/abl solo nelle cellule resistenti all’imatinib. Questo dato è supportato anche dalla presenza di Bcr/Abl negli immunoprecipitati di CK2 ottenuti dai medesimi lisati e analizzati mediante western blot e spettrometria di massa. Dato che la relazione fra CK2e Bcr/Abl suggerisce una potenziale fosforilazione di CK2 da parte della tirosin-chinasi, si è realizzata un’immunoprecipitazione con l’anticorpo anti-fosfo-tirosina (p-Tyr) da lisati di cellule LAMA84-S/R e l’analisi tramite western blot degli immunoprecipitati rileva la presenza di CK2 solo nei campioni delle LAMA84-R. La Tyr-fosforilazione di CK2aumenta se le cellule sono trattate con l’inibitore delle tirosin-fosfatasi, pervanadato. Per provare se la Tyr-fosforilazione di CK2 è mediata dall’autofosforilazione di CK2, come descritto altrove, o è catalizzata da Bcr/Abl, le cellule LAMA84-R sono state trattate per 24 h con inibitori specifici per CK2 o Bcr/Abl. CK2è stata immunoprecipitata dalle cellule trattate ed è stata analizzato il suo stato di Tyr-fosforilazione mediante western blot. Mentre il CX-4945, un inibitore selettivo per CK2, ora in fase I degli studi clinici su pazienti con tumori solidi, non ha effetto sulla p-Tyr-CK2l’imatinib riduce la Tyr-fosforilazione di CK2, suggerendo che Bcr/Abl è maggiormente coinvolto nella fosforilazione tirosinica di CK2nelle cellule LAMA84-R. Per esaminare il potenziale effetto di CK2 e Bcr/Abl nell’interazione delle due chinasi, le cellule LAMA84-R sono state trattate con il CX-4945, l’imatinib, l’inibitore allosterico di Abl GNF-2, e il potente inibitore chinasico non-specifico staurosporina. Solo il trattamento con l’inibitore di CK2, CX-4945, riduce l’interazione fra le due chinasi. Per sottolineare il ruolo di CK2 durante la proliferazione cellulare, le cellule LAMA84-S/R sono state trattate per 48 h con differenti concentrazioni di CX-4945 e la vitalità cellulare di entrambe le cellule LAMA84-S e LAMA84-R è stata misurata mediante il saggio MTT. I dati suggeriscono che la viabilità di entrambe le linee cellulari decresce all’aumentare della concentrazione del CX-4945, con un maggior effetto dell’inibitore nelle cellule LAMA84-R. Esperimenti effettuati mediante la combinazione di CX-4945 e imatinib, dimostrano che mentre la vitalità delle cellule LAMA84-S trattate con l’imatinib da solo o in combinazione con il CX-4945 è ridotta in modo simile, l’inibizione dell’attività di CK2 da parte del CX-4945 sensibilizza le cellule LAMA84-R a basse concentrazioni di imatinib. Infine, la possibile interazione fra CK2 e altre proteine è stata analizzata nelle cellule resistenti all’imatinib. A questo proposito, CK2 è stata immunoprecipitata da lisati di cellule LAMA84-R e la sua attività CK2 negli immunocomplessi è stata valutata mediante un saggio chinasico in presenza di [33P]ATP. L’analisi mediante SDS/PAGE dei campioni reattivi evidenzia una banda, di circa 35-38 kDa, 33P-fosforilata in modo comparabile alla banda corrispondente alla subunità CK2 autofosforilata. L’analisi di spettrometria di massa ha dimostrato che la banda corrisponde alla subunità j del fattore eucariotico 3 d’inizio della traduzione (eIF3j) e il sito di fosforilazione è stato identificato nella Ser127 (Q-E-E-S-D-L-E). L’analisi di spettrometria di massa degli immunoprecipitati di CK2 ha messo in evidenza la presenza di altre subunità di eIF3: b, f, l, g, h, k. Gli immunoprecipitati di eIF3b ottenuti da lisati di cellule LAMA84-R contengono sia CK2cheCK2 e la fosforilazione in vitro degli immunoprecipitati di eIF3b in presenza di [33P]ATP ha dimostrato che anche eIF3b è un substrato di CK2.
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