I G-quadruplex sono strutture secondarie a quattro filamenti che possono essere formate all’interno di acidi nucleici ricchi nella composizione di guanine; i G-quadruplex sono implicati in importanti funzioni biologiche: questi agiscono come regolatori epigenetici a livello genomico in cellule umane, procariotiche e anche in virus. I G-quadruplex agiscono come silenziatori a livello di regioni promotoriali in geni umani e, inoltre, sono stati riportati in letteratura per il loro diretto coinvolgimento nella regolazione dell’espressione genica. Poiché il virus dell’Herpes Simplex di Tipo 1 (HSV-1) possiede un genoma caratterizzato da un’elevata percentuale di basi guanine (il 68%), e le strutture G-quadruplex identificate sono massivamente presenti durante la replicazione del virus stesso, abbiamo deciso di investigare la possibilità di agire direttamente su tali G-quadruplex attraverso l’utilizzo di un Naftalene Diimmide con core esteso (c-exNDI) per ottenere un’attività antivirale caratterizzata da un innovativo meccanismo d’azione. Mediante caratterizzazione biofisica e biomolecolare abbiamo dimostrato che tale composto (c-exNDI) è in grado di stabilizzare sequenze G-quadruplex in modo concentrazione-dipendente e, ulteriormente è in grado di inibire il processamento della Taq polimerasi, in fase di elongazione del DNA, in corrispondenza delle strutture G-quadruplex. Abbiamo inoltre dimostrato che il composto testato (c-exNDI) è in grado di riconoscere preferenzialmente i G-quadruplex virali rispetto ai G-quadruplex formati a livello delle regioni telomeriche che, all’interno di una cellula eucariotica, rappresentano i G-quadruplex maggiormente presenti. Il trattamento di cellule infettate con HSV-1 con il composto in analisi, utilizzato a basse concentrazioni, ha causato una significativa inibizione della produzione virale con parallela scarsa citotossicità sulle cellule. Infine, abbiamo dimostrato che il meccanismo d’azione di tale composto risiede nell’inibizione G-quadruplex-mediata della replicazione del DNA virale, con conseguente alterazione a valle della trascrizione genica. Tali dati suggeriscono che la potente attività antivirale e la scarsa citotossità di tale composto dipendono principalmente da una combinazione di maggiore affinità del composto per i G-quadruplex virali e dalla loro massiccia presenza durante il processo di infezione. Poiché la maggior parte dei composti leganti G-quadruplex è caratterizzata da un’ estesa superficie aromatica planare che li rende scarsamente farmaco-simili, ci siamo focalizzati sullo studio di una libreria di composti, precedentemente creata per agire sui G-quadruplex presenti nei promotori di oncogeni in cellule tumorali, al fine di valutare la capacità di tali composti di legare e stabilizzare i G-quadruplex presenti in HSV-1 e di esprimere un’attività antivirale diretta contro il medesimo virus. In questa parte di progetto abbiamo dimostrato che tutti i composti della libreria sono in grado di legare e stabilizzare i G-quadruplex virali secondo un meccanismo concentrazione-dipendente e, nuovamente, sono in grado di alterare la processività della polimerasi attraverso un ingombro sterico correlato alla formazione della struttura G-quadruplex. Il trattamento di cellule infettate da HSV-1 con ciascuno dei composti della libreria a basse concentrazioni, ha mostrato una cospicua diminuzione della produzione virale. Poiché due dei quattro composti sono risultati scarsamente citotossici, per questi sono stati ottenuti promettenti indici di selettività (SI). Il meccanismo di azione di tali composti, come già visto in precedenza, è stato ascritto all’inibizione G-quadruplex-mediata della polimerasi in fase di replicazione del DNA virale. Poiché tutti i composti della libreria sono caratterizzati da (i) strutture chimiche promettenti (dimensione più contenuta rispetto a quella di composti leganti G-quadruplex precedentemente sviluppati come BRACO-19 (B-19) e le Naftalene Diimmidi) e (ii) mostrano una potente attività contro HSV-1 a basse concentrazioni e una scarsa citotossicità, possono essere considerati composti fortemente adatti per lo sviluppo di nuovi farmaci leganti G-quadruplex contro HSV-1, e contro ceppi di HSV-1 resistenti al trattamento con Acyclovir (ACV), con caratteristiche fortemente farmaco-simili. Nella terza parte del presente progetto di tesi, mediante un approccio di pull-down, abbiamo cercato di identificare proteine, sia cellulari che virali, in grado di interagire con strutture G-quadruplex presenti in cellule infettate. Risultati preliminari hanno portato all’identificazione di proteine sia cellulari che virali direttamente implicate in meccanismi di replicazione e trascrizione del genoma virale. Per quanto riguarda le proteine cellulari, abbiamo identificato le proteine nucleari ribonucleoproteina U (hnRNPU), nucleolina, nucleofosmina e le proteine istoniche 11 e 12; alcune di queste proteine (hnRNP, nucleolina e nucleofosmina) erano già state riportate in letterature per la loro capacità di legare i G-quadruplex durante la replicazione della cellula. L’identificazione delle proteine istoniche 11 e 12 suggerisce la possibilità che le strutture G-quadruplex siano direttamente coinvolte nel mantenimento del genoma virale nel processo di latenza che tale virus è in grado di stabilire a livello di cellule del sistema nervoso centrale nell’uomo. Tra le proteine virali abbiamo identificato il fattore di trascrizione ICP4, la proteina legante il DNA a singola catena ICP8, il fattore di processività della polimerasi PAP1 e la proteina capsidica VP5. L’identificazione delle proteine ICP4, ICP8 e PAP1, direttamente implicate in meccanismi di replicazione e trascrizione, conferma l’ipotesi di un diretto coinvolgimento delle strutture G-quadruplex nei meccanismi di replicazione e trascrizione del genoma virale. Inoltre, l’identificazione della proteina capsidica VP5 suggerisce la possibilità che le strutture G-quadruplex siano direttamente coinvolte nel processo di incapsidamento delle particelle virali neo-formate come guida per l’incapsidamento del genoma virale. Infine, attraverso lo studio del genoma RNA a singolo filamento a polarità negativa del virus del Morbillo (MV), abbiamo dimostrato la presenza di sette sequenze caratterizzate da un’elevata probabilità di formare strutture G-quadruplex. Sei delle sette sequenze identificate hanno mostrato effettiva capacità di formare strutture secondarie G-quadruplex, mentre per una è stata dimostrata la capacità di formare una struttura secondaria a forcina. Tutte le sequenze hanno mostrato una stabilizzazione a seguito del legame con il composto B-19 e il trattamento delle cellule infettate ha mostrato una pronunciata riduzione nella sintesi del genoma virale. In conclusione, dato che (i) le sequenze G-quadruplex sono fortemente conservate e distribuite in molteplici genomi virali (come ad esempio è stato dimostrato nel virus dell’Immunodeficienza Umano HIV-1, in HSV-1 e in MV) a causa della loro implicazione nella regolazione di diversi processi biologici, e (ii) diverse molecole leganti G-quadruplex (B-19, c-exNDI e piccole molecole di una libreria di composti) si sono dimostrate attive contro diversi virus attraverso un meccanismo di inizibione G-quadruplex-mediata della replicazione, possiamo confermare che le strutture G-quadruplex possono essere considerate come un ottimo bersaglio farmacologico per il trattamento di infezioni causate da diversi agenti eziologici e, inoltre, che piccole molecole in grado di legare e stabilizzare i G-quadruplex possono rappresentare innovativi farmaci con un nuovo meccanismo d’azione.

G-quadruplexes in the Herpes Simplex Virus Type 1 and Measles Virus genomes: new antiviral targets

CALLEGARO, SARA;Sara Richter
2017

Abstract

I G-quadruplex sono strutture secondarie a quattro filamenti che possono essere formate all’interno di acidi nucleici ricchi nella composizione di guanine; i G-quadruplex sono implicati in importanti funzioni biologiche: questi agiscono come regolatori epigenetici a livello genomico in cellule umane, procariotiche e anche in virus. I G-quadruplex agiscono come silenziatori a livello di regioni promotoriali in geni umani e, inoltre, sono stati riportati in letteratura per il loro diretto coinvolgimento nella regolazione dell’espressione genica. Poiché il virus dell’Herpes Simplex di Tipo 1 (HSV-1) possiede un genoma caratterizzato da un’elevata percentuale di basi guanine (il 68%), e le strutture G-quadruplex identificate sono massivamente presenti durante la replicazione del virus stesso, abbiamo deciso di investigare la possibilità di agire direttamente su tali G-quadruplex attraverso l’utilizzo di un Naftalene Diimmide con core esteso (c-exNDI) per ottenere un’attività antivirale caratterizzata da un innovativo meccanismo d’azione. Mediante caratterizzazione biofisica e biomolecolare abbiamo dimostrato che tale composto (c-exNDI) è in grado di stabilizzare sequenze G-quadruplex in modo concentrazione-dipendente e, ulteriormente è in grado di inibire il processamento della Taq polimerasi, in fase di elongazione del DNA, in corrispondenza delle strutture G-quadruplex. Abbiamo inoltre dimostrato che il composto testato (c-exNDI) è in grado di riconoscere preferenzialmente i G-quadruplex virali rispetto ai G-quadruplex formati a livello delle regioni telomeriche che, all’interno di una cellula eucariotica, rappresentano i G-quadruplex maggiormente presenti. Il trattamento di cellule infettate con HSV-1 con il composto in analisi, utilizzato a basse concentrazioni, ha causato una significativa inibizione della produzione virale con parallela scarsa citotossicità sulle cellule. Infine, abbiamo dimostrato che il meccanismo d’azione di tale composto risiede nell’inibizione G-quadruplex-mediata della replicazione del DNA virale, con conseguente alterazione a valle della trascrizione genica. Tali dati suggeriscono che la potente attività antivirale e la scarsa citotossità di tale composto dipendono principalmente da una combinazione di maggiore affinità del composto per i G-quadruplex virali e dalla loro massiccia presenza durante il processo di infezione. Poiché la maggior parte dei composti leganti G-quadruplex è caratterizzata da un’ estesa superficie aromatica planare che li rende scarsamente farmaco-simili, ci siamo focalizzati sullo studio di una libreria di composti, precedentemente creata per agire sui G-quadruplex presenti nei promotori di oncogeni in cellule tumorali, al fine di valutare la capacità di tali composti di legare e stabilizzare i G-quadruplex presenti in HSV-1 e di esprimere un’attività antivirale diretta contro il medesimo virus. In questa parte di progetto abbiamo dimostrato che tutti i composti della libreria sono in grado di legare e stabilizzare i G-quadruplex virali secondo un meccanismo concentrazione-dipendente e, nuovamente, sono in grado di alterare la processività della polimerasi attraverso un ingombro sterico correlato alla formazione della struttura G-quadruplex. Il trattamento di cellule infettate da HSV-1 con ciascuno dei composti della libreria a basse concentrazioni, ha mostrato una cospicua diminuzione della produzione virale. Poiché due dei quattro composti sono risultati scarsamente citotossici, per questi sono stati ottenuti promettenti indici di selettività (SI). Il meccanismo di azione di tali composti, come già visto in precedenza, è stato ascritto all’inibizione G-quadruplex-mediata della polimerasi in fase di replicazione del DNA virale. Poiché tutti i composti della libreria sono caratterizzati da (i) strutture chimiche promettenti (dimensione più contenuta rispetto a quella di composti leganti G-quadruplex precedentemente sviluppati come BRACO-19 (B-19) e le Naftalene Diimmidi) e (ii) mostrano una potente attività contro HSV-1 a basse concentrazioni e una scarsa citotossicità, possono essere considerati composti fortemente adatti per lo sviluppo di nuovi farmaci leganti G-quadruplex contro HSV-1, e contro ceppi di HSV-1 resistenti al trattamento con Acyclovir (ACV), con caratteristiche fortemente farmaco-simili. Nella terza parte del presente progetto di tesi, mediante un approccio di pull-down, abbiamo cercato di identificare proteine, sia cellulari che virali, in grado di interagire con strutture G-quadruplex presenti in cellule infettate. Risultati preliminari hanno portato all’identificazione di proteine sia cellulari che virali direttamente implicate in meccanismi di replicazione e trascrizione del genoma virale. Per quanto riguarda le proteine cellulari, abbiamo identificato le proteine nucleari ribonucleoproteina U (hnRNPU), nucleolina, nucleofosmina e le proteine istoniche 11 e 12; alcune di queste proteine (hnRNP, nucleolina e nucleofosmina) erano già state riportate in letterature per la loro capacità di legare i G-quadruplex durante la replicazione della cellula. L’identificazione delle proteine istoniche 11 e 12 suggerisce la possibilità che le strutture G-quadruplex siano direttamente coinvolte nel mantenimento del genoma virale nel processo di latenza che tale virus è in grado di stabilire a livello di cellule del sistema nervoso centrale nell’uomo. Tra le proteine virali abbiamo identificato il fattore di trascrizione ICP4, la proteina legante il DNA a singola catena ICP8, il fattore di processività della polimerasi PAP1 e la proteina capsidica VP5. L’identificazione delle proteine ICP4, ICP8 e PAP1, direttamente implicate in meccanismi di replicazione e trascrizione, conferma l’ipotesi di un diretto coinvolgimento delle strutture G-quadruplex nei meccanismi di replicazione e trascrizione del genoma virale. Inoltre, l’identificazione della proteina capsidica VP5 suggerisce la possibilità che le strutture G-quadruplex siano direttamente coinvolte nel processo di incapsidamento delle particelle virali neo-formate come guida per l’incapsidamento del genoma virale. Infine, attraverso lo studio del genoma RNA a singolo filamento a polarità negativa del virus del Morbillo (MV), abbiamo dimostrato la presenza di sette sequenze caratterizzate da un’elevata probabilità di formare strutture G-quadruplex. Sei delle sette sequenze identificate hanno mostrato effettiva capacità di formare strutture secondarie G-quadruplex, mentre per una è stata dimostrata la capacità di formare una struttura secondaria a forcina. Tutte le sequenze hanno mostrato una stabilizzazione a seguito del legame con il composto B-19 e il trattamento delle cellule infettate ha mostrato una pronunciata riduzione nella sintesi del genoma virale. In conclusione, dato che (i) le sequenze G-quadruplex sono fortemente conservate e distribuite in molteplici genomi virali (come ad esempio è stato dimostrato nel virus dell’Immunodeficienza Umano HIV-1, in HSV-1 e in MV) a causa della loro implicazione nella regolazione di diversi processi biologici, e (ii) diverse molecole leganti G-quadruplex (B-19, c-exNDI e piccole molecole di una libreria di composti) si sono dimostrate attive contro diversi virus attraverso un meccanismo di inizibione G-quadruplex-mediata della replicazione, possiamo confermare che le strutture G-quadruplex possono essere considerate come un ottimo bersaglio farmacologico per il trattamento di infezioni causate da diversi agenti eziologici e, inoltre, che piccole molecole in grado di legare e stabilizzare i G-quadruplex possono rappresentare innovativi farmaci con un nuovo meccanismo d’azione.
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