Alveolar Rhabdomyosarcoma 3D model development to mimic physiological cell-ECM interactions with focus on integrins.

Introduzione: Rabdomiosarcoma (RMS) è il sarcoma dei tessuti molli più frequente in età pediatrica, le due sottoclassi principali sono quella embrionale (ERMS), associata ad una prognosi favorevole, e quella alveolare (ARMS) altamente metastatica e con prognosi sfavorevole. Se da un lato la conoscenza del profilo genetico di RMS è ben approfondita, l’aspetto della caratterizzazione del suo microambiente è ancor’oggi poco definita. Finora, le interazioni tra cellule tumorali e stromali sono state indagate con modelli in vitro 2D. Tuttavia, questi modelli non sono rappresentativi dei complessi processi biologici che avvengono in vivo, tra i quali la migrazione cellulare. Questa dipende dalle interazioni 3D tra cellule e la matrice extracellulare (ECM) attraverso molecole di adesione come le integrine. Difatti, le interazioni cellula-cellula e cellula-ECM sono ben rappresentate in modelli 3D, che mimano meglio la condizione fisiologica. Scopo: Lo scopo di questo lavoro è lo sviluppo di un modello 3D di RMS, in grado di ricreare le interazioni cellula-matrice, con particolare attenzione sulle integrine, e di rappresentare i processi di migrazione cellulare che avvengono in condizioni fisiologiche. Materiali e Metodi: Sono state eseguite analisi bioinformatiche sull’espressione di geni della ECM di pazienti affetti da ARMS e da ERMS. Per il primo modello 3D, le masse di ARMS sono state decellularizzate mediante trattamento detergente-enzimatico. Tre differenti strategie di ricellularizzazione sono state testate: semina superficiale, microiniezione e bioreattore a perfusione. L’analisi proteomica del tessuto di ARMS è stata eseguita per determinare la composizione proteica della ECM. Sono stati sviluppati due ulteriori modelli 3D basati su: Ultrafoam e hydrogels di acido ialuronico/PEG (HA/PEG). Il ruolo di ITGA5 nella motilità cellulare è stato investigato in vitro a seguito di trasfezione con siRNA. La crescita tumorale e la migrazione metastatica sono stati testati in vivo. Risultati: 15 geni correlati alla ECM risultano differenzialmente espressi tra pazienti affetti di ARMS ed ERMS. Per il primo modello 3D, le masse di ARMS sono state decellularizzate ma le tecniche di ricellularizzazione non hanno garantito un buon risultato in termini di distribuzione e vitalità cellulare. La composizione della matrice riporta collageni (tipo I e III), fibrillina, fibronectina e periostina. Tra i due ulteriori modelli 3D, Ultrafoam fornisce una struttura simile al tessuto con: superiore proliferazione (41% contro 24%), secrezione di MMP-2 e sovra espressione dei geni ITGA5 e CXCR4 rispetto ai controlli 2D. Gli hydrogels di HA/PEG formano un supporto 3D dove gli sferoidi non dimostrano invasività. L’inibizione in vitro di ITGA5 risulta in una ridotta abilità migratoria (24.3% contro 43.9% nel controllo). Nel test di invasività entrambe le cellule risultano incapaci di invadere il Matrigel, tuttavia è stata osservata una differente organizzazione cellulare tra cellule di controllo e silenziare. La crescita tumorale in vivo non mostra associazione con la presenza di ITGA5; tuttavia, la frequenza di extravasazione risulta maggiore in presenza di ITGA5 (30.6% contro 8.5%). Discussione: Tra i modelli 3D testati, l’utilizzo diretto della matrice decellularizzata ha evidenziato una ridotta porosità del supporto, risultando in una distribuzione di cellule superficiale e la prevalenza di interazioni cellula-cellula piuttosto che cellula-ECM. Il supporto di Ultrafoam ha prodotto i migliori risultati in termini di interazioni cellula-microambiente; tuttavia, il bioreattore è inaccessibile per la visualizzazione al microscopio. D’altra parte, l’hydrogel è otticamente trasparente e più direttamente funzionalizzabile con altre proteine di matrice specifiche di ARMS. Negli hydrogels di HA/PEG, la concentrazione di fibronectina verrà ottimizzata assieme all’aggiunta di altre proteine di matrice. I risultati in vitro evidenziano che altre proteine cooperano nella migrazione cellulare nelle cellule di ARMS. La differente organizzazione in Matrigel suggerisce un cross-talk tra ITGA5 e proteine di adesione cellula-cellula. I risultati in vivo indicano che ITGA5 non è necessaria per la crescita tumorale, tuttavia sembra avere un ruolo funzionale nel processo di extravasazione. Conclusioni: Questo lavoro ha sviluppato tre differenti modelli 3D per lo studio di ARMS, ciascuno con vantaggi e svantaggi che devono essere considerati a seconda del processo biologico da investigare. In futuro prevediamo che un’analisi più dettagliata del microambiente di ARMS potrà portare alla luce di nuovi marcatori prognostici e terapeutici per migliorare la sopravvivenza dei giovani pazienti.