ARRHYTHMOGENIC CARDIOMYOPATHY: FOCUS ON NOVEL DISEASE MODELS AND BIOMARKER IDENTIFICATION

La cardiomiopatia aritmogena (ACM) è una delle cardiomiopatie più comuni, caratterizzata dalla perdita progressiva di cardiomiociti e dalla formazione di tessuto fibro-adiposo a livello del miocardio. Dal punto di vista clinico, ACM si manifesta con aritmie ventricolari, sincope, e morte cardiaca improvvisa. ACM, ereditata come carattere autosomico dominante a penetranza incompleta, presenta eterogeneità genetica e considerevole variabilità fenotipica a livello inter- e intra-familiare. Tra i geni malattia che sono stati identificati fino ad ora, quelli che codificano per le proteine desmosomiali placofilina-2 (PKP2), desmogleina-2 (DSG2), e desmoplachina (DSP) sono i più frequentemente mutati. Nonostante sia stato dimostrato che le mutazioni causative non solo conducono a difetti strutturali ma possono anche interferire con le vie di segnalazione cellulare, ad ora le informazioni riguardo i meccanismi molecolari che inducono il fenotipo della malattia sono ancora inesplorati. Nella prima parte di questa tesi, è stata completata la caratterizzazione fenotipica di un nuovo modello murino transgenico (Tg-hQ) recentemente generato nel nostro laboratorio, il quale sovraesprime la proteina desmogleina-2 umana portatrice di una mutazione nonsenso (p.Q558*) identificata in precedenza in un paziente con ACM. Questa linea murina ha mostrato il tipico fenotipo ACM, inclusa, tra le altre cose, la significativa riduzione del numero e delle dimensioni dei desmosomi. Inoltre, dall’analisi di sequenziamento del trascrittoma eseguita su cuori di topi Tg-hQ e topi non transgenici, è stata individuata l’alterazione di miR-217-5p, miR-499-5p, e miR-708-5p. Al fine di investigare il ruolo dei progenitori fibro-adipogenici cardiaci (cFAPs) nella sostituzione fibro-adiposa tipicamente osservabile nell’ACM, è stato ottimizzato un protocollo specifico per l’isolamento di questa popolazione cellulare. Dato che i cFAPs isolati dai ventricoli di topi Tg-hQ hanno mostrato un maggiore potenziale adipogenico se comparati con i controlli, si è inoltre testato in maniera preliminare un nuovo approccio farmacologico per contrastare il differenziamento dei cFAPs in adipociti, mostrando risultati promettenti. Nella seconda parte di questa tesi, oltre a fornire una panoramica sullo “stato dell’arte” dell’utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) per lo studio di malattie cardiovascolari, abbiamo descritto la generazione di un nuovo modello in vitro basato su cardiomiociti derivati da hiPSCs (hiPS-CMs), le quali sono state ottenute dalle cellule somatiche di un paziente con ACM portatore della stessa mutazione di DSG2 che è sovraespressa nel modello murino Tg-hQ. Partendo da cellule epiteliali renali ottenute per esfoliazione, è stata generata una nuova linea di hiPSCs (DSG2 Q558*) che è stata ampliamente caratterizzata allo scopo di confermarne la pluripotenza. Inoltre, al fine di correggere la mutazione e generare dunque dei controlli isogenici, sono state progettate e testate due strategie, una delle quali ancora in fase di valutazione, basate sull’utilizzo del sistema CRISPR/Cas9. In questo studio, le hiPSCs DSG2 Q558* sono state differenziate in hiPS-CMs, ed è stata svolta una caratterizzazione preliminare del fenotipo che ha mostrato una ridotta espressione del gene DSG2 rispetto ai hiPSC-CMs WT. Inoltre, si è osservata down-regolazione di un insieme di geni che codificano per proteine dei dischi intercalari, comprendenti DSC2, GJA1, e SCN5A. Oltre a riportare alterazioni nell’espressione genica di componenti meccanici ed elettrici dei dischi intercalari, è stata osservata anche sovraespressione del gene ATP2A2, suggerendo che difetti dei flussi del calcio potrebbero essere coinvolti nell’insorgenza del fenotipo dell’ACM. Infine, è stata confermata l’alterazione dell’espressione del miR-708-5p e del miR-499-5p in hiPS-CMs mutati, seppur quest’ultimo abbia mostrato un andamento opposto in confronto ai risultati riportati nel modello Tg-hQ. Infine, la terza parte di questa tesi si colloca all’interno di un campo della ricerca emergente nell’ambito dell’ACM, rappresentato dall’identificazione di biomarkers circolanti specifici per la malattia che potrebbero ricoprire un ruolo fondamentale nel riconoscimento precoce dell’ACM. In questo studio, è stato osservato un significativo aumento dell’espressione del miR-185-5p nel plasma di 37 pazienti con ACM. La sovraespressione di questo miRNA circolante anche in un’altra coorte di pazienti ACM supporta fortemente il potenziale ruolo del miR-185-5p come biomarker circolante e non invasivo per questa malattia.