Optimization of biomimetic nanovesicles for the treatment of solid tumors and inflammation in the child and adult.

Questo progetto di ricerca è volto all’ottimizzazione di nanovescicole biomimetiche derivate da leucociti denominate Leucosomi (Leuko) con la capacità di veicolare farmaci selettivamente a tessuti infiammati e tumori solidi. Questi nanovettori sono disegnati per veicolare farmaci a ntinfiammatori e antitumorali nei tessuti infiammati che caratterizzano patologie infiammatorie croniche e in alcune neoplasie, al fine di aumentare il loro accumulo negli organi target e ridurne l’esposizione a tessuti sani con un miglioramento della loro efficacia, minimizzazione dei loro gravi effetti collaterali e delle dosi necessarie. In passato, molti nanovettori sono stati sviluppati usando diversi materiali naturali e sintetici. La maggior parte di queste formulazioni si basano sui principi di targeting attivo e passivo per il direzionamento al tessuto target. Tuttavia, questi sistemi sono progettati seguendo una strategia “bottom-up”, in cui le diverse componenti del nanovettore vengono assemblate per ottenere formulazioni con un comportamento sempre più complesso e specifico. Anche se questo approccio offre un eccellente controllo sulle condizioni di produzione, la complessità di alcuni sistemi lo rende molto laborioso e difficile da sviluppare su larga scala per la produzione industriale. L’uso di vescicole biomimetiche permette di combinare questa strategia con un approccio “top-down”, in cui proteine di membrana purificate dai leucociti sono inserite nello strato fosfolipidico di vescicole formando i Leuko. In particolare, l’uso di proteine di membrana derivate da globuli bianchi fornisce alle particelle l’identità biologica e le funzioni dei leucociti stessi, incluse la loro capacità di circolare nel sangue a lungo, mediata da proteine quali CD45 e CD47. Inoltre, proteine come CD11b, LFA-1 ed integrine mediano l’adesione all’ endotelio nei tessuti infiammati. La dimensione nanometrica di queste vescicole permette loro di sfruttare l’effetto EPR per aumentare ulteriormente il loro targeting nei tumori solidi. Nella prima fase di questo progetto è stato ottimizzato un protocollo per l’estrazione e purificazione di proteine di membrana che fosse semplice, economico e riproducibile (Figura 1). Nella fattispecie, sono state usate linee cellulari di monociti umani e murini, visto che la rapida replicazione e facilità di coltura fornisce molte cellule di partenza con un fenotipo relativamente stabile. Il protocollo di estrazione delle proteine di membrana (NEXT) si è basato su tre passaggi principali: il primo consiste nel lavaggio delle cellule per rimuovere le proteine presenti nel terreno di coltura; il secondo nella permeabilizzazione delle cellule per permettere l’efflusso di proteine citosoliche e del citoscheletro, usando un buffer contenente un detergente blando (Digitonina 0,015% m/v, buffer di estrazione 1, EB1); nell’ultimo passaggio viene effettuata la solubilizzazione della membrana plasmatica con un detergente non denaturante ma più forte (Triton X-100, buffer di estrazione 2, EB2) il quale permette anche di stabilizzare le proteine di membrana includendo i loro domini idrofobici nelle micelle. La resa e purezza finale delle proteine ottenute con NEXT sono state paragonate con quelle ottenute con un kit commerciale (KIT). Dopo aver effettuato i lavaggi, il primo step è stato ottimizzato valutando diversi rapporti tra EB1 e numero di cellule, misurando la loro permeabilizzazione con saggi turbidimetrici. La quantità di EB1 minima per ottenere la completa permeabilizzazione dei monociti è risultata 100 μL di EB1 per milione di cellule. La stessa analisi è stata effettuata sul secondo passaggio, in questo caso utilizzando diverse concentrazioni di Triton X-100 (0.1% e 0.5% v/v). Questa ottimizzazione ha dimostrato come l’aumento di detergente presente in EB2 potesse migliorare significativamente la solubilizzazione delle membrane e risultasse in una resa proteica più alta (fino a 2,5 mg di proteine per mL di estratto, comparabile al KIT), senza specifici requisiti di volume. Questi risultati hanno validato il protocollo NEXT che può essere applicato a differenti quantità di cellule variando i volumi di EB1 ed EB2. La purezza degli estratti ottenuti con NEXT sono anche stati analizzati usando SDS- PAGE e Western Blot con uno specifico set di proteine di membrana e di altri compartimenti cellulari. Questa analisi semi-quantitativa ha dimostrato come le proteine di membrana (CD11b e Calnexina) erano effettivamente arricchite negli estratti ottenuti da NEXT rispetto al lisato cellulare completo (TCL), fino a cinque volte di più, e le proteine citosoliche (β-actina e GAPDH), oltre a quelle nucleari (NP-62) sono risultate molto ridotte o assenti. Inoltre, la purezza delle proteine di membrana aumentava con la quantità di detergente presente in EB2. Infine, i risultati sono stati confermati usando la spettrometria di massa, la quale ha mostrato una complessiva riduzione nel numero complessivo di diverse proteine negli estratti ottenuti dal KIT (402) e nel NEXT (227) rispetto al TCL (516), con allo stesso tempo una percentuale più alta di proteine di membrana negli estratti di NEXT (17,9%), rispetto al KIT (12.3%) ed al TCL (9.1%). Dopo aver effettuato l’estrazione delle proteine di membrana, il secondo step del consiste nell’inserirle nello strato fosfolipidico delle nanovescicole, ottenendo i Leuko (Figura 1). Tuttavia, molte caratteristiche dei Leuko devono essere ottimizzate per rendere questa formulazione adatta agli studi preclinici. In particolare, i Leuko dovrebbero avere un diametro idrodinamico tra i 50 ed i 200 nm, una distribuzione di dimensioni omogenea (con un PDI di 0,2 o minore) e una buona funzionalizzazione con le proteine di membrana. Per formulare i Leuko, è stato utilizzato il sistema di microfluidica NanoassemblrTM. Questo approccio si basa sulla miscelazione veloce ed omogenea di una fase liquida acquosa ed una organica. Il NanoassemblrTM permette l’auto-assemblamento rapido e scalabile di molte nanoparticelle (NPs) con base lipidica per cambiamento nella polarità del solvente durante il processo di miscelazione. In particolare, la fase acquosa dei Leuko è composta da proteine di membrana disperse in un tampone di ammonio solfato 250 mM per permettere il caricamento remoto di doxorubicina (DOXO). La fase organica consiste in una soluzione di fosfolipidi e colesterolo in etanolo. Di conseguenza, l’assemblamento dei Leuko e l’inserimento delle proteine di membrana avvengono in un solo step. I parametri sperimentali per questo processo, inclusi la velocità totale di flusso nel sistema (TFR), il rapporto di flusso tra le fasi (FRR) e quello tra proteine di membrana ed i lipidi devono essere ottimizzati per ottenere Leuko con le caratteristiche desiderate. Dunque, le caratteristiche dei Leuko tra cui diametro idrodinamico, distribuzione di dimensioni, e loading di proteine sono state ottimizzate mediante Design of Experiment (DoE) al fine di selezionare i valori dei parametri considerati ottimali, usando il minor numero possibile di corse sperimentali con diversi valori parametrici. L’approccio DoE permette infatti di creare combinazioni di valori dei parametri sperimentali considerati che coprano molte condizioni diverse simultaneamente. Nella nostra ottimizzazione abbiamo selezionato range di valori parametrici da 1mL/min a 10mL/min per il TFR, da 1:1 a 1:5 per il FRR, e da 1:300 a 1:20 per il rapporto tra proteine e lipidi. Ciascuna combinazione corrisponde ad una corsa sperimentale con specifiche condizioni. I dati sperimentali sono stati analizzati e interpolati per creare un modello matematico che permettesse di prevedere i risultati del processo sulla base dei valori parametrici utilizzati. Sulla base delle predizioni offerte dal nostro modello, i parametri ottimali si sono rivelati essere un TFR di 1mL/min, un FRR di 4.88:1 (fase acquosa di fase alcolica, v/v) ed un rapporto di massa tra lipidi e proteine di 20:1. Questa combinazione di parametri ha permesso di ottenere Leuko con un diametro di 150 nm, un PDI≈0.2, ed un potenziale zeta molto negativo (-25mV), che suggerisce un efficiente inserimento delle proteine di membrana. L’inserimento delle proteine di membrana sui Leuko è stato anche confermato con la tecnica ortogonale di citofluorimetria, in cui abbiamo utilizzato un ampio screen di anticorpi contro diversi marker espressi delle cellule immunitarie. Questa tecnica ha confermato la presenza di numerosi marker immunitari ed il loro corretto orientamento sui Leuko rispetto ai semplici Lipo. I Leuko sono stati dunque caricati con il farmaco antitumorale modello doxorubicina (DOXO) usando un metodo di loading remoto con un’efficienza di incapsulamento del 70%. È stato anche studiato il rilascio del farmaco, dimostrando un profilo di rilascio graduale e dipendente da pH. Nello specifico, DOXO viene rilasciata dai Leuko più velocemente a pH leggermente acido (pH=6), corrispondente al pH dei lisosomi. Questo profilo è adeguato per il rilascio intracellulare di DOXO dopo endocitosi e previene il rilascio nel circolo sanguigno (pH=7,4). Nell’ultima parte del progetto (Figura 1), si è valutata la capacità dei Leuko di aderire a cellule endoteliali infiammate usando la microscopia a fluorescenza, oltre al tasso di internalizzazione dei Leuko da parte delle cellule di osteosarcoma SAOS-2 e delle cellule di cancro colon-retto HCT-116. In quest’ultime, l’internalizzazione ha dimostrato di crescere col tempo. Inoltre, il pattern intracellulare puntato citosolico delineato dalle NPs suggerisce un meccanismo di internalizzazione endocitico. Infine, abbiamo testato la citotossicità di Lipo e Leuko caricati con DOXO sulle linnee di cellule tumorali sopra specificate sia in condizioni di coltura “piatta”, sia su sferoidi tumorali ottenuti coltivando le cellule in un idrogel che funzioni da supporto bioattivo per la crescita di sferoidi tumorali (GeltrexTM). I Leuko caricati con DOXO hanno dimostrato in entrambi i modelli una citotossicità verso cellule tumorali superiore a quella della DOXO libera. La citotossicità delle particelle è stata testata anche su organoidi di cancro colon-rettale derivati da pazienze. I risultati di questo progetto costituiscono un proof-of-concept al fine di stabilire un framework per l’ottimizzazione di sistemi biomimetici per il drug delivery che possano essere formulati utilizzando diverse linee cellulari di partenza e con numerose possibili applicazioni in contesti patologici sia tumorali che di infiammazione acuta e cronica. Lo sviluppo di nuovi sistemi biomimetici inoltre aprirebbe la via alla formulazione di terapie personalizzate ottenute da cellule “self” derivate da paziente che coniughino alta efficacia con una migliore biocompatibilità.