Infezione da Herpes simplex virus-1 nel sistema nervoso enterico: un innovativo modello di alterazione della motilità intestinale

Functional gastrointestinal disorders (FGIDs) are common diseases in the general population, that range from life-threatening conditions to less severe but highly invalidating conditions (Talley, 2008). Although disturbances in gastrointestinal (GI) motility can occur as a result of a variety of factors, the damage to the functional and/or structural integrity of the enteric nervous system (ENS), plays a major role in FGIDs (De Giorgio e Camilleri, 2004). Infectious agents, such as neurotropic viruses, may be an important etiologic factor because of their ability to disrupt the integrity of the ENS, either directly or through immune-mediated mechanisms. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), a widespread neurotropic virus, when delivered intraluminally into mice, has been shown to affect the ENS and seems to be involved in the pathogenesis of FGIDs (Gesser and Koo, 1996). We have recently reported that, after intragastric (IG) administration, HSV-1 infects the ENS (De Giorgio et al., 2007). The aim of this PhD research project was to evaluate the effect of HSV-1 infection on gut contractility following pharmacological/electrical stimulation of rat ileum segments, mounted vertically in organ baths. A significant upward shift of the concentration-response curves to the muscarinic agonist, carbachol, and increased ileum contractions induced by CaCl2 were shown in ileum segments at 1 and 6 weeks (W) post IG infection (PI), whereas KCl-evoked contractions and neurally-mediated cholinergic responses to electric field stimulation (EFS) were significantly modified only at 1-2 W. KCl-evoked [3H]acetylcholine release was significantly reduced 1 and 6 W PI, further supporting the presence of an enteric cholinergic nerve dysfunction during viral infection. Nonadrenergic, noncholinergic (NANC; 20 Hz)-induced relaxation was significantly augmented at 1 W, which is indicative of an altered NANC inhibitory pathway during early HSV-1 infection. Our results suggest that HSV-1 infection in the ENS alters both receptor-mediated and nonreceptor-mediated responses of rat ileum in a complex mode since this virus directly invades the ENS and triggers a localized mild inflammatory reaction (Brun et al., 2010). Considering the significant role of adenosine in regulating intestinal motility and influencing enteric neurotrasmission, the effects of the virus were assessed on the mechanical responses of the rat small intestine to adenosinergic receptor stimulation. HSV-1 infection in rat ENS appears again to be associated with a compromised purinergic-control of ileum motility at 1 and 6 W PI. Western blotting and immunofluorescence experiments on whole mount preparations also revealed an alteration of adenosine deaminase expression and a modified distribution of A1 and A2a receptors, respectively. Induction of inflammatory cytokines by HSV-1 is mediated by Toll-like receptor (TLR) 2, that plays a critical role in the early innate immune response to invading pathogens (Kurt-Jones et al., 2004; Kurt-Jones et al., 2005). To study the role of immune responses to HSV-1 in the onset of intestinal dismotility the infection protocol developed in rats was used in C57Bl/6 mice, since TLR2 knock out (KO) transgenic animals are available. Receptor-mediated and nonreceptor-mediated responses of ileum segments from wild type (WT) and KO mice were impaired in the early stages of infection as well as in the late study period. Moreover, an altered neuronal excitability and/or neurotransmitter release was shown in the infected gut. These results indicate that HSV-1 IG infection alters mouse small intestinal motility too and that the deletion of TRL2 gene leads to small bowel neuromuscular abnormalities, pointing out the involvement of innate immunity in intestinal motility, not only during HSV-1 infection but also under physiological conditions. In conclusion, this PhD thesis highlights that HSV-1 infection in the ENS significantly affects gut motor function and appears to be a suitable model for studying the mechanisms responsible for the onset of FGIDs, expecially when triggered by a neurotropic virus infection.

I disordini funzionali dell'apparato gastrointestinale (DFGI) presentano un’elevata prevalenza nella popolazione occidentale e possono essere estremamente invalidanti, compromettendo la qualità di vita dei pazienti che ne sono affetti (Talley, 2008). Anche se la patofisiologia è multifattoriale, recenti studi hanno evidenziato che anomalie del sistema nervoso enterico (SNE) sono alla base di DFGI. Il SNE occupa infatti un ruolo centrale nella modulazione delle funzioni intestinali e, di conseguenza, anche nella regolazione della motilità (De Giorgio e Camilleri, 2004). Agenti infettivi, come i virus neurotropi, sembrano coinvolti nell'insorgenza di anomalie motorie del tratto gastrointestinale (GI), dal momento che sono in grado di alterare il SNE sia in modo diretto che attraverso reazioni immuno-mediate. L’Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1), un virus neurotropo comunemente diffuso nella nostra società, se somministrato nel lume esofageo del topo, è in grado infettare il SNE e sembra essere coinvolto nella genesi di DFGI (Gesser e Koo, 1996). Abbiamo recentemente dimostrato che il virus, inoculato per via intragastrica (IG) nel ratto, infetta il SNE (De Giorgio et al., 2007). Gli studi condotti nel mio periodo di dottorato hanno avuto come scopo la valutazione degli effetti del trattamento in vivo con HSV-1 sulla motilità intestinale degli animali trattati, mediante esperimenti di contrattilità su preparati di ileo, montati verticalmente in bagni per organo isolato. L’infezione IG con HSV-1 ha determinato un aumento della risposta all’agonista muscarinico carbacolo ed al CaCl2 nell’ileo di ratti infettati da una e sei settimane. La contrazione indotta dal KCl e la risposta colinergica evocata dalla stimolazione elettrica a campo (EFS) sono risultate invece variate solamente dopo una-due settimane dalla somministrazione IG del virus. La liberazione di acetilcolina triziata in seguito a depolarizzazione dei segmenti con KCl è risultata ridotta dopo ad una e sei settimane dall'infezione, confermando che la presenza del virus nel SNE altera la trasmissione nervosa colinergica. Inoltre, gli esperimenti di EFS hanno evidenziato un aumento della risposta rilasciante non adrenergica non colinergica (NANC) ad una settimana, suggerendo che il virus modifica anche la neurotrasmissione inibitoria. I risultati ottenuti suggeriscono che HSV-1 modifica la risposta contrattile sia recettore-mediata che non- in maniera peculiare: nella prima fase dell’infezione il virus interagisce direttamente con il SNE, mentre nello stadio tardivo la variazione della contrattilità intestinale appare riconducibile ad un basso grado di infiammazione indotto dalla presenza del patogeno (Brun et al., 2010). Lo studio della risposta recettore-mediata si è quindi focalizzato sull’effetto del trattamento in vivo sulla contrazione mediata dal sistema dell'adenosina, di cui è noto il ruolo nella modulazione della motilità intestinale e della neurotrasmissione enterica. Anche in questo caso sono state evidenziate alterazioni funzionali dopo una e sei settimane dall’inoculo IG. Nell’ileo dei ratti infettati con HSV-1 è stata inoltre dimostrata una modificata espressione di ADA, enzima strettamente coinvolto nella fine regolazione dei livelli di adenosina, e dei recettori A1 ed A2a. Il protocollo di infezione con il virus è stato quindi applicato a topi C57/Bl6 Wild Type (WT) ed a topi deficienti per il gene che codifica per il recettore Toll-like (TLR) 2, coinvolto nello sviluppo della risposta immunitaria innata contro i patogeni ed implicato nella produzione di citochine infiammatorie in risposta all'invasione di HSV-1. Sono state dunque indagate eventuali alterazioni della contrattilità intestinale imputabili alla delezione del gene e/o al trattamento in vivo con HSV-1. L'HSV-1 ha determinato nell’ileo evidenti variazioni della risposta recettore-mediata e non- sia nelle fasi iniziali che tardive dell'infezione. Inoltre, è stata dimostrato che anche nel topo l’infezione virale causa un’alterazione dell’eccitabilità neuronale e/o del rilascio di neurotrasmettitori a livello enterico. I risultati indicano altresì che i TLR2 rivestono un ruolo primario nella trasmissione neuromotoria enterica non solo durante l’infezione ma anche in condizioni fisiologiche. Alla luce dei risultati ottenuti, il mio lavoro di ricerca evidenzia come l’infezione enterica da HSV-1 possa rappresentare un nuovo modello di alterazione della contrattilità intestinale per lo studio dei meccanismi base responsabili dell’insorgenza di DFGI ed, in particolare, nelle alterazioni motorie indotte dai virus neurotropi.