Agonists of the Cannabinoid Receptor Type 1 (CB1) Promote Rat Cerebellar Neural Progenitor Cell Proliferation Through Activation of ERK and Akt Pathways

Endocannabinoids represent a novel class of intercellular messengers, the function of which includes retrograde signaling in the brain and mediation or modulation of several types of synaptic plasticity. Endocannabinoid signaling not only regulates the proliferation, migration, specification, survival, and phenotypic differentiation of neural progenitors during central nervous development (Harkany,T. et al., 2008) but has been shown to control proliferation and differentiation of neural stem/progenitor cells in the hippocampal subgranular zone and in the subventricular zone of the adult mammalian brain (Jiang,W. et al., 2005; Palazuelos,J. et al., 2006). To elucidate the cellular and molecular mechanisms underlying cannabinoid neurogenic action, we used neural progenitor cells isolated from primary cultures of rat postnatal cerebellum as an in vitro model of neural cell proliferation. These cells share some of the phenotypic and genotypic properties of stem cells, as characterized by immunocytochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction, respectively (Zusso,M. et al., 2004). The functional presence of the two cannabinoid receptors CB1 and CB2 in cerebellar neural progenitor cells at 10 days in vitro (DIV) was assessed by immunocytochemistry and Western blotting. Proliferation was evaluated using a [3H]-thymidine incorporation assay. A significant increase in cerebellar neural progenitor cell proliferation vs the corresponding vehicle control was found following 24 h incubation with the synthetic non-selective CBR agonists WIN 55,212-2 (100 nM) or CP 55,940 (1000 nM) (43 ± 22 % and 37 ± 8 %, respectively), which was completely abolished by treatment with 1000 nM AM 251 (1 h pre-incubation), a selective CB1 receptor antagonist. To evaluate a direct involvement of the CB1 receptor in the proliferative response, cerebellar neural progenitors were incubated for 24 h with ACEA (1-1000 nM), a potent selective CB1 receptor agonist. ACEA (1 nM and 10 nM) significantly increased [3H]-thymidine incorporation (by 50.59 ± 6.72 % and 35.77 ± 4.48 %, respectively) and this effect was completely reverted by 10 nM AM 251. To investigate the involvement of the mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase (ERK)1,2 and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase-3-β signaling pathways in CB1 receptor-induced cerebellar neural progenitor proliferation, we performed SDS-PAGE Western blotting. Fifteen minutes incubation of cerebellar neural progenitor cells with 1 nM ACEA produced a significant activation of Akt (36.54 ± 7.21%) that persisted up to 30 min (21 ± 5 %). A significant, concomitant ERK1,2 activation (32 ± 4 %) was observed at this time, as well. A 1 h pre-incubation with 10 nM AM 251 per se did not affect Akt and MAPK phosphorylation levels but did inhibit the ACEA agonistic effect on both kinases. The existence of cross-talk between the two pathways was confirmed by using the corresponding selective inhibitors, LY294002 (75 µM, 3 h pre-incubation) and U0126 (10 µM, 1 h pre-incubation). The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 not only inhibited 1 nM ACEA-induced cerebellar neural progenitor Akt activation but also ERK phosphorylation, while the mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor U0126 inhibited ERK activation without affecting the Akt pathway, both in untreated and ACEA-treated cells. Preliminary experiments have been performed to investigate the potential role of ACEA in cerebellar neural progenitor cell differentiation, evaluating the expression pattern of the transcript variants of the ARE-binding protein AUF1, which is regulated during postnatal cerebellar development (Hambardzumyan,D. et al., 2009).

Gli endocannabinoidi rappresentano una nuova classe di messaggeri intercellulari che mediano la conduzione retrograda del segnale sinaptico e regolano così varie forme di plasticità sinaptica. Il segnale endocannabinoide non solo controlla la proliferazione cellulare, la migrazione, il destino decisionale, la sopravvivenza, ed il differenziamento ad un fenotipo maturo dei progenitori neurali durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale (Harkany,T. et al., 2008), ma è stato dimostrato possedere un ruolo nella proliferazione e nel differenziamento di cellule staminali/progenitrici neurali esistenti nella zona subgranulare di ippocampo e nella zona subventricolare del cervello di mammifero adulto (Jiang,W. et al., 2005; Palazuelos,J. et al., 2006). Allo scopo di definire i meccanismicellulari e molecolari che sottendono all’azione neurogenica di questi composti, è stato utilizzato un modello di proliferazione cellulare neurale in vitro rappresentato da cellule progenitrici neurali isolate da colture primarie di cervelletto di ratto postnatale. La caratterizzazione di queste cellule, sia genotipica, tramite RT-PCR, che fenotipica, tramite analisi immunocitochimica, ha evidenziato che esse possiedono proprietà tipiche delle cellule staminali (Zusso,M. et al., 2004). La presenza funzionale dei due recettori cannabici CB1 e CB2 nelle cellule progenitrici neurali cerebellari a 10 giorni in coltura (10 days in vitro, DIV) è stata confermata tramite analisi immunocitochimica e Western blotting. La proliferazione cellulare è stata valutata tramite saggio d’incorporazione di timidina triziata. Tramite questo saggio è stato riscontrato un aumento significativo rispetto al controllo della proliferazione dei progenitori neurali cerebellari, per trattamento di 24 ore con gli agonisti sintetici non selettivi dei recettori cannabici, WIN 55,212-2 (100 nM) o CP 55,940 (1000 nM) (43 ± 22 % e 37 ± 8 %, rispettivamente), completamente inibito dal pretrattamento di un’ora con l’antagonista selettivo del recettore CB1 AM 251 (1000 nM). Al fine di valutare il diretto coinvolgimento del recettore CB1 nella risposta proliferativa, le cellule progenitrici neurali cerebellari sono state incubate per 24 ore con ACEA, potente agonista selettivo del recettore CB1. ACEA, alla concentrazione di 1 e 10 nM, ha indotto una significativa incorporazione del radionuclide rispetto alle cellule non trattate (50.59 ± 6.72 % e 35.77 ± 4.48 %, rispettivamente), ma la risposta è stata completamente inibita da AM 251 allaconcentrazione 10 nM. Allo scopo di studiare il coinvolgimento delle cascate di trasduzione del segnale MEK/ERK1,2 ed IP3K/Akt/GSK3-β nella risposta proliferativa delle cellule progenitrici mediata dall’attivazione del recettore CB1, è stata usata la tecnica del SDS-PAGE Western blotting. L’incubazione delle cellule progenitrici con 1 nM ACEA ha prodotto un incremento significativo dei livelli di attivazione di Akt a 15 minuti (36.54 ± 7.21%) che persiste fino a 30 minuti di trattamento (21 ± 5 %), tempo a cui si registra un concomitante aumento dei livelli di fosforilazione della proteina ERK (32 ± 4 %). Il trattamento di 60 minuti con AM 251 alla concentrazione 10 nM non influenza i livelli basali di attivazione delle due chinasi, ma inibisce completamente l’effetto mediato da ACEA. Successivamente è stato possibile confermare l’esistenza di un "cross-talk" tra le due cascate di trasduzione del segnale tramite impiego dei rispettivi inibitori selettivi. L’inibitore della fosfatidilinositolo-3 chinasi, LY294002 (75 µM, 3 ore di preincubazione), ha inibito l’attivazione di entrambe le chinasi nelle cellule progenitrici trattate con ACEA, mentre l’inibitore di MEK, U0126 (10 µM, un’ora di preincubazione), ha inibito l’attivazione di ERK in cellule trattate e non, senza influenzare la fosforilazione di Akt. Sono stati eseguiti alcuni esperimenti preliminari per valutare un potenziale ruolo di ACEA nel differenziamento delle cellule progenitrici neurali cerebellari, tramite analisi dell’espressione delle varianti trascrizionali della proteina AUF1 che lega sequenze ricche di adenina e uracile dell’RNA messaggero ed è regolata durante lo sviluppo cerebellare postnatale (Hambardzumyan,D. et al., 2009).