In situ and in vitro techniques for studying rumen fermentations: methodology and applications

Abstract The general aim of this thesis was to study rumen fermentation processes using in situ and in vitro digestibility and in vitro gas production techniques. The thesis includes the results of five experiments. The first experiment investigated the validity to reduce the amount of feed sample incubated in filter bags with DaisyII (from 0.50 to 0.25 g feed/bag). This hypothesis was verified by considering the results of two separate trials (conducted on 4 and 7 feeds, respectively) in which the digestibility values provided by DaisyII were compared with those achieved using a conventional batch culture. Results evidenced that, by using the lower sample size (0.25 g feed/bag), digestibility values provided by DaisyII resulted more similar, less variable and better correlated with those achieved with the batch culture. The second experiment was conducted on 11 feeds and compared the digestibility values achieved: i) in situ and in vitro using two different kinds of bag (nylon and filter) with a different pore size (40 and 25 µm); ii) in situ, placing the bags in the rumen environment, and in vitro using rumen fluid collected from intact cows by a suction technique. Results of the experiment showed that the use of filter bags induced a systematic, but predictable, underestimation of digestibility values compared to the nylon bags. Rumen fluid collected from intact cows provided digestibility values directly proportional to those obtained in situ. This latter result is relevant, as the validity of using rumen fluid collected from intact cows can be of interest for many research centers, in order to overcome ethical and public concerns related to the use of surgically treated animals. The third experiment was conducted on the same feeds analysed in the second experiment and it was aimed to compare the energy value of feeds estimated using three different equations: i) one equation based on feed chemical composition and in situ digestible NDF at 48 h of incubation (MENRC); ii and iii) two equations based on feed chemical composition and in vitro gas production at 24 h of incubation (MEMenke and MEUCD). A further aim was to evaluate the validity of reducing the in situ incubation time from 48 to 24 h. Results of the trial evidenced that, when MENRC estimates were taken as reference, MEUCD equation provided feed energy estimates more accurate and precise compared to MEMenke. However, the accuracy and precision of MEMenke estimates increased when four feeds rich in protein (CP > 16% DM) were excluded from the analysis. As the in situ digestibility values achieved at 24 and 48 h were highly correlated and showed a comparable reproducibility, the reduction of in situ incubation time from 48 to 24 h seems can be proposed for reducing the cost of the tests. The fourth experiment was aimed to compare the effects of two different systems of gas release (venting at fixed times or at fixed pressure) on gas production (GP) kinetics provided by two feeds with a different degradability (meadow hay and corn meal), using an innovative GP system. Results of the experiment showed that the venting system exerted significant effects on GP kinetics. The effects were particularly accentuated for corn meal and for venting at fixed times. Therefore, when venting at fixed times is applied, the headspace volume of GP system, the venting frequency and the amount of fermentable matter incubated must be carefully balanced to avoid the generation of high pressures, which could alter GP kinetics. However, venting at fixed pressure is preferable to that at fixed times, as it can strongly reduce these shortcomings. The fifth experiment aimed to evaluate the effects of increasing dosages of two antioxidants (BHT and a red chicory extract) on some in vitro rumen parameters, when they are incubated with meadow hay and corn meal. Results of the experiment showed that the two antioxidants exerted only small effects on rumen degradability, GP kinetics and volatile fatty acids profile. At the highest dosage, the red chicory extract showed to improve the efficiency of nitrogen utilization in the rumen, by increasing the amount of nitrogen captured by rumen microbes and utilized for microbial protein synthesis

Riassunto Lo scopo generale del presente lavoro di tesi è stato quello di studiare le fermentazioni ruminali mediante la tecnica in situ, e le più moderne tecniche in vitro che valutano la digeribilità e la produzione di gas degli alimenti zootecnici. La tesi comprende i risultati di 5 diverse prove sperimentali. L’obiettivo della prima prova è stato quello di valutare la possibilità di ridurre la quantità di campione alimentare incubato all’interno dei filter bags previsti dal sistema DaisyII (da 0,50 a 0,25 g di alimento/filter bag). La suddetta ipotesi è stata verificata analizzando i risultati ottenuti in due differenti prove sperimentali, condotte rispettivamente su 4 e 7 alimenti, il cui comune obiettivo era il confronto dei valori di digeribilità forniti dal DaisyII e da un sistema in vitro tradizionale. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, con l’incubazione di 0,25 g di alimento/filter bag, i valori di digeribilità forniti dal DaisyII risultavano complessivamente meno variabili, meglio correlati e comparabili con quelli forniti dal sistema in vitro tradizionale. La seconda prova sperimentale è stata condotta su 11 alimenti e si poneva l’obiettivo di confrontare i valori di digeribilità ottenuti: i) in situ, attraverso l’impiego di due diversi tipi di sacchetto (nylon e filter bags) caratterizzati da una differente porosità (40 e 25 µm); in situ, incubando i campioni alimentari direttamente nel rumine dell’animale, ed in vitro, incubando i campioni alimentari con liquido ruminale prelevato mediante sonda esofagea da bovine non fistolate. I risultati della prova hanno evidenziato che l’utilizzo dei filter bags, in sostituzione dei nylon bags, induceva una sottostima sistematica, ma comunque stimabile, dei valori di digeribilità degli alimenti. I campioni alimentari incubati in vitro con liquido ruminale prelevato da bovine non fistolate hanno fornito valori di digeribilità direttamente proporzionali a quelli incubati in situ. Un tale risultato è sicuramente soddisfacente: la possibilità di utilizzare liquido ruminale prelevato da bovine non fistolate può rappresentare infatti un’importante opportunità per molti centri di ricerca, consentendo di superare le problematiche di natura etica legate all’impiego di bovine sottoposte ad operazione chirurgica per l’applicazione di fistole ruminali permanenti. La terza prova sperimentale è stata condotta sugli stessi alimenti impiegati nel secondo contributo e si poneva l’obiettivo di determinare il valore energetico degli alimenti applicando tre differenti equazioni: i) un’equazione basata sulla composizione chimica dell’alimento e sul valore di digeribilità della fibra misurato in situ dopo 48 h di incubazione (MENRC); ii e iii) due equazioni basate sulla composizione chimica dell’alimento e sulla produzione di gas misurata in vitro dopo 24 h di incubazione (MEMenke e MEUCD). Un secondo scopo era quello di valutare la possibilità di ridurre il tempo di incubazione in situ da 48 a 24 h. I risultati della prova hanno dimostrato che, prendendo come riferimento le stime di valore energetico ottenute applicando l’equazione MENRC, l’equazione MEUCD forniva stime più accurate e precise rispetto all’equazione MEMenke. Tuttavia, il livello di accuratezza e di precisione dell’equazione MEMenke è migliorato notevolmente escludendo i quattro alimenti proteici (PG > 16% SS) dall’analisi. Poiché i valori di digeribilità ottenuti in situ a 24 e a 48 h sono risultati fortemente correlati e hanno evidenziato una riproducibilità comparabile, la riduzione del tempo di incubazione in situ da 48 a 24 h può rappresentare una valida soluzione al fine di contenere i costi di analisi. La quarta prova sperimentale ha valutato gli effetti di due diverse modalità di rilascio del gas (a tempi fissi oppure a pressione fissa) sulle cinetiche di produzione di gas fornite da due alimenti caratterizzati da un differente livello di degradabilità ruminale (un fieno di graminacee e una farina di mais). Ai fini della prova è stato utilizzato un sistema innovativo per la misurazione del gas prodotto dalla fermentazione di matrici alimentari. I risultati della prova hanno evidenziato che la modalità di rilascio del gas ha condizionato significativamente le produzioni di gas fornite dai due alimenti. Tali effetti sono risultati particolarmente rilevanti nel caso della farina di mais e nel caso del rilascio a tempi fissi. Alla luce di questi risultati, quando si adotta la modalità di rilascio a tempi fissi, lo spazio di testa del sistema, la frequenza di rilascio del gas e la quantità di campione alimentare incubato dovrebbero essere opportunamente bilanciati per evitare lo sviluppo di pressioni molto elevate all’interno del sistema, le quali potrebbero alterare le normali cinetiche di produzione del gas. Comunque, al fine di ridurre tali rischi, l’impiego di sistemi che rilasciano il gas a pressione fissa è da ritenersi preferibile. La quinta prova sperimentale ha valutato gli effetti di due sostanze antiossidanti (il BHT ed un estratto di radicchio) dosate a due livelli differenti ed incubate con farina di mais e fieno di graminacee, sui principali parametri ruminali. I risultati della prova hanno evidenziato che i due antiossidanti hanno esercitato effetti poco rilevanti sulla degradabilità ruminale, sulle produzioni di gas e sui profili acidici forniti dai due alimenti. Al dosaggio più elevato, l’estratto di radicchio ha tuttavia migliorato il bilancio azotato ruminale, favorendo un aumento significativo della quota di azoto impiegato dai microorganismi ruminali per la sintesi di proteina batterica