The circadian clock of Drosophila going wild: PERIOD and TIMELESS oscillations under natural conditions

The circadian clock of the fruit fly Drosophila melanogaster relies on 7 groups of clock neurons per brain hemisphere which are bilaterally clustered in dorsal (DN1s, DN2s and DN3s) and lateral (s-LNvs, l-LNvs, LNds and LPNs) according to their positions in the brain. In these neurons, clock genes such as period (per) and timeless (tim) operate in interlocked feed-back loops. Under rectangular 12:12 light:dark (LD) regimes and constant temperature PER and TIM proteins start to accumulate in the cytoplasm of all clock neurons in the middle of the night and reach their maximum levels at the end of the dark phase. At lights-on TIM is degraded in a light dependent manner; in the absence of TIM, PER is also degraded. To date, almost all behavioural and molecular analyses of fly circadian rhythmicity have been carried out in the laboratory. Nevertheless laboratory conditions do not reflect the complexity of the stimuli that are present in the natural environment. In 2006 our lab started a research project (granted by the European Commission, 6th Framework Programme; Project EUCLOCK N° 018741), in collaboration with the group of Prof. C. P: Kyriacou at the Department of Genetics, University of Leicester (UK), dealing with the characterization of the circadian clock of D. melanogaster under real natural conditions. To investigate the functioning of the circadian clock in a real natural environment we studied PER and TIM expression in the circadian clock neurons of flies exposed to natural conditions throughout 2008 and 2009. The flies analysed belong to the WT-ALA (Wild Type ALto Adige) strain of D. melanogaster which has been established in 2006 from a natural population sampled in the North of Italy. Upon analysis of PER and TIM expression profiles within the clock neurons of fruit flies experiencing real natural environment we found that, unexpectedly, PER and TIM oscillations appear to be decoupled in certain circumstances. In fact, under long and hot days as in Summer conditions (Natural LD~ 15:9; Tmax~35°C; Tmin~25°C) the peak of PER is advanced and the peak of TIM delayed, leading to an oscillation almost in antiphase. Moreover, we hypothesize that the decoupling in PER and TIM oscillation profiles is linked to the decoupling in the phase of the morning and evening burst of activity also observed under natural conditions (Bhutani et al., submitted). In addition, we observed that, irrespectively of the season, the peak of PER within the DN1s is always advanced compared to that within the lateral cells and this phase advance do not depends on PDF signaling. Once the molecular oscillation profiles of PER and TIM under natural conditions were revealed, we attempted to reproduce our findings under laboratory conditions. This part of the project was achieved thanks to the collaboration with Prof. Charlotte Helfrich-Förster's laboratory, at the Department of Neurobiology and Genetics, University of Würzburg (DE). In particular, wild type flies were entrained to laboratory LD 16:8 regimes in which the slow increasing and decreasing in light intensity typical of natural dawns and dusks was simulated, at two different constant temperatures (20°C and 30°C). We confirmed that the huge phase shift between PER and TIM oscillations which characterizes natural Summer days is caused, at least in part, by high temperatures, albeit natural thermocycles appear to be stronger environmental cues than constant high temperatures. Moreover, we observed that the phase advance in PER cycling within the DN1s hold true in the lab under the particular conditions we used for the entrainment. Therefore, we hypothesize that this phase advance is mainly a response to a specific environmental conditions, namely the ramping in light intensities we used to simulate sunrise and sunset.

La sede anatomica del core dell’orologio circadiano di D. melanogaster è costituita da circa 100 neuroni per emisfero cerebrale, suddivisi in 7 gruppi: 3 gruppi di neuroni dorsali (DN1s, DN2s e DN3s) e 4 gruppi di neuroni laterali (s-LNvs, l-LNvs, LNds, e LPNs). A livello molecolare, l'orologio circadiano consta di un sistema di loop a retroazione negativa interconnessi tra loro. In condizioni standard di laboratorio, ovvero in regimi di LD 12:12 e a temperatura costante, i geni period (per) e timeless (tim) vengono trascritti ad opera dei fattori di trascrizione CLOCK (CLK) e CYCLE (CYC). Le proteine PERIOD (PER) e TIMELESS (TIM) si accumulano durante la notte e raggiungono un picco alla fine della notte/inizio del giorno, in maniera sincrona in tutti i neuroni orologio. Verso la fine della notte, PER e TIM entrano nel nucleo, dove inibiscono la trascrizione degli stessi geni che li codificano (per e tim). All'accensione della luce i livelli di TIM scendono rapidamente a causa della degradazione luce dipendente mediata dal fotorecettore per la luce blu CRYPTOCHROME (CRY). In assenza di TIM, anche PER va incontro a degradazione. Ad oggi, gli studi sull'orologio circadiano di Drosophila sono stati condotti esclusivamente in condizioni di laboratorio, anche se in qualche caso si è cercato di riprodurre le caratteristiche dell'ambiente naturale. Tuttavia, gli stimoli ambientali a cui i moscerini sono esposti in laboratorio sono di gran lunga meno complessi degli stimoli realmente presenti in natura. Nell'ambiente naturale la luce cambia continuamente, sia per quanto riguarda la sua intensità che la composizione del suo spettro ed anche la temperatura è soggetta a variazioni continue più o meno accentuate a seconda della stagione e della latitudine. Nel 2006 il nostro laboratorio ha avviato un progetto di ricerca (EU Project EUCLOCK N° 018741, 6th Framework Programme) in collaborazione con il gruppo del Prof. C.P. Kyriacou (Department of Genetics, University of Leicester, UK) con l'obiettivo di studiare e caratterizzare il funzionamento dell'orologio circadiano di Drosophila in condizioni naturali. In questo lavoro sono riportati i risultati della sperimentazione condotta nell'ambito della mia tesi di dottorato che si è concentrato sull'analisi dei profili di oscillazione delle proteine PER e TIM nei diversi neuroni orologio di moscerini esposti a condizioni naturali. Il ceppo di moscerini selvatici utilizzato negli esperimenti (WT-ALA) è stato stabilizzato a partire da una collezione di linee isofemminili campionate nel 2006 nel Nord Italia (Val Venosta, BZ). L'analisi dei dati ottenuti nelle diverse condizioni ambientali analizzate, (rappresentative delle quattro stagioni) ci ha permesso di rilevare che i profili di oscillazione di PER e TIM appaiono disaccoppiati in certe condizioni ambientali. Infatti, abbiamo riscontrato che quando le giornate sono lunghe e calde (Primavera/Estate) il picco di PER è ritardato rispetto a quello che si osserva in giornate più corte e fresche (Autunno) mentre quello di TIM sembra anticipare. Questi spostamenti dei picchi delle due proteine fanno si che, in particolare durante l'Estate, PER e TIM mostrino il loro massimo di espressione in alcuni gruppi di neuroni orologio con quasi 12 ore di differenza; PER e TIM sembrano quindi oscillare in antifase. Abbiamo osservato inoltre che, indipendentemente dalle condizioni ambientali cui sono esposti i moscerini, PER raggiunge il picco di espressione prima nei DN1s e successivamente nei neuroni orologio laterali. Abbiamo inoltre dimostrato che questa anticipazione dei DN1s è indipendente dal neuropeptide PDF, prodotto da s-LNvs e l-LNvs e implicato nell'output dell'orologio circadiano. Dopo aver descritto in dettaglio i profili di oscillazione di PER e TIM in condizioni naturali, abbiamo ritenuto opportuno, al fine di identificare le componenti ambientali responsabili dei fenomeni osservati, cercare di riprodurre in laboratorio i risultati ottenuti, apportando alcune modificazioni mirate ai tradizionali profili (rettangolari) di LD e alle temperature utilizzati negli esperimenti di laboratorio. Questi esperimenti sono stati condotti in collaborazione con il gruppo della Prof.ssa C. Helfrich-Förster (Department of Neurobiology and Genetics, University of Würzburg, DE). Abbiamo esposto i moscerini a cicli di LD 16:8 e simulato albe e tramonti mediante variazioni controllate dell'intensità luminosa, a due differenti temperature costanti (20°C e 30°C). Con questi esperimenti abbiamo potuto confermare quanto avevamo ipotizzato analizzando i risultati ottenuti in condizioni naturali, ovvero che lo spostamento delle fasi dei picchi di PER e TIM sia non solo determinato dal fotoperiodo ma, almeno in parte, anche dalla temperatura. Inoltre, tali esperimenti ci hanno permesso di collegare l'anticipazione del picco di PER nei DN1s al graduale aumento o diminuzione dell'intensità luminosa che si verifica normalmente durante l'alba e il tramonto.