The phytocomplex from Pistacia lentiscus, a shrub of the Anacardiaceae family, is an essential oil obtained by hydrodistillation of leaves, fruits or from a trunk exudate (mastic gum). The mastic gum has been known to be effective in several gastric diseases, against Helicobacter Pylori and for its antibacterial and antifungine activities. Furthermore, Pistacia oil's major chemical constituents are monoterpenes with chemiopreventive and chemiotherapic properties. We investigated the antiproliferative properties of the volatile oil from Pistacia lentiscus twigs and leaves using human cell lines from ovarian (2008 and cis-platinum resistant, C13*) and colon (LoVo) adenocarcinoma, and human stable fibroblast line (HFFF2) as in vitro models. The MTT test showed that, after 3-hour treatment, phytocomplex (about 150 µg/ml) was able to inhibit the growth of all adenocarcinoma cell lines. After 24 hour treatment the IC50 on 2008 and LoVo cells resulted 3 times lower. On fibroblast line the phytocomplex was active only after 72 hour treatment. Western blotting analysis confirmed the oil capability to reduce carcinoma cell growth by decreasing the expression of p-ERK, MAPKs induced by mitogenic stimuli. In treated cells: vacuolisation, decreasing cellular size and brightness, directly proportional to reduction of cell viability, were observed by optical microscope. Using annexin V with propidium iodide we observed that oil was able to stimulate apoptosis in a dose-dependent manner. ROS has been recognized as an important mediator of the stress response; in particular, by regulating the loss of mitochondrial membrane potential. Furthermore upstream of ROS generation there is a respiratory chain block that leads even an increase of mitochondrial membrane potential. Analysis of mitochondrial membrane potential, with Rhodamine123, and ROS generation, with H2DCF-DA, showed the oil capability to activate mitochondrial apoptotic pathway. Oil-treatment also induced alteration on H+ gradient and interruption of electron flow between respiratory chain complexes III and IV, thereby causing loss of ATP. In the initiation of apoptosis caspases play critical roles. They can be grouped into "apoptotic initiators", for example caspase 8 and 9, and "apoptotic effectors", such as caspase 3, according to their substrate specificities and target proteins. Our data indicated that Pistacia lentiscus oil caused programmed cell death via a caspase-dependent pathway. In fact, after 3 hour treatment and 21 hour incubation, caspase 3 activity level, resulted higher than in the control, especially for the highest dose used. We also performed a flow cytometry-based cell cycle analysis, observing that the phytocomplex induced dose-dependent arrest in G2/M phase by decreasing cyclin B1 levels on all adenocarcinoma lines, especially on ovarian cells, and acting on acetylated tubulin and microtubules' polymerization/depolymerization.
Il fitocomplesso ricavato da Pistacia lentiscus, una pianta arbustiva della famiglia delle Anacardiaceae, è un olio essenziale ottenuto per idrodistillazione da foglie, frutti o dall'essudato del tronco (mastice). Il mastice (il più noto dei fitocomplessi) è risultato essere efficace verso vari disturbi a livello gastrico e contro l'Helicobacter Pylori ed inoltre di avere attività antibatterica ed antifungina. I principali costituenti degli oli ottenuti dal genere Pistacia sono i monoterpeni che presentano proprietà preventive e chemioterapiche. Oggetto di studio di questi tre anni di dottorato è un olio essenziale di Pistacia lentiscus, ottenuto per idrodistillazione da foglie e ramoscelli, testato su una linea cellulare di adenocarcinoma del colon (cellule LoVo), una di adenocarcinoma dell'ovaio (cellule 2008) e la loro variante cis-platino resistente (cellule C13*) ed una linea di fibroblasti umani (cellule HFFF2). Il test dell'MTT dimostra che dopo 3 ore di trattamento il fitocomplesso, alla dose di 150 µg/ml circa, è in grado di inibire la proliferazione di tutte le linee di adenocarcinoma. Dopo 24 ore di trattamento, invece, l'IC50 risulta 3 volte inferiore per le linee LoVo e 2008. Per contro, sulla linea non tumorale di fibroblasti umani il fitocomplesso si dimostra attivo solo dopo 72 ore di trattamento. L'analisi mediante Western blotting conferma la capacità dell'olio di ridurre la crescita cellulare delle cellule di adenocarcinoma diminuendo in maniera dose-dipendente l'espressione delle p-ERK, MAP chinasi indotte da stimoli mitogeni. Mediante microscopia ottica, inoltre, si può apprezzare come le cellule trattate risultino più piccole, rotondeggianti e meno "luminose", ad indicare una loro minore vitalità . Approfondendo i meccanismi d'azione dell'olio (mediante l'utilizzo di annexina V e ioduro di propidio) si osserva che il trattamento è in grado di attivare nelle cellule tumorali meccanismi di morte cellulare programmata. E' noto che i ROS sono degli importanti mediatori della risposta agli stress cellulari, in particolare attraverso la mediazione della perdita del potenziale della membrana mitocondriale, e che, a monte della produzione di ROS, c'è un blocco della catena respiratoria che porta ad un concomitante aumento del potenziale della membrana mitocondriale. Le analisi di questo, mediante Rodamina 123, e della generazione di ROS, utilizzando H2DCF-DA, dimostrano la capacità dell'olio di attivare la via apoptotica mitocondriale. Il trattamento è quindi anche in grado di indurre un'alterazione nel gradiente protonico ed un'interruzione del passaggio di elettroni attraverso la catena respiratoria causando così anche la diminuzione della produzione di ATP. Nell'attivazione del processo apoptotico le caspasi giocano un ruolo cruciale. Questi enzimi, a seconda della specificità di substrato e del target, possono essere raggruppati in "niziatori" o "effettori" di apoptosi, tra questi ultimi la caspasi 3 risulta essere sicuramente la più importante. I nostri risultati indicano che l'olio di Pistacia lentiscus è in grado di attivare la morte cellulare programmata attraverso la via caspasi-dipendente. Infatti, dopo 3 ore di trattamento e 21 di incubazione, i livelli della caspasi 3 si dimostrano più alti rispetto a quelli del controllo, specialmente per la dose maggiore adottata. E' stata effettuata anche un'analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare che ha permesso di osservare come il fitocomplesso induca un arresto del ciclo in fase G2/M in maniera dose-dipendente. Questo arresto avviene attraverso una diminuzione dei livelli citoplasmatici di ciclina B1, specialmente nelle linee di adenocarcinoma ovarico, e agendo sui livelli di tubulina acetilata e sui meccanismi di polimerizzazione/depolimerizzazione dei microtubuli.
Studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell'attività antiproliferativa dell'olio essenziale di Pistacia lentiscus / Casarin, Elisabetta. - (2011 Jan 27).
Studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell'attività antiproliferativa dell'olio essenziale di Pistacia lentiscus
Casarin, Elisabetta
2011
Abstract
Il fitocomplesso ricavato da Pistacia lentiscus, una pianta arbustiva della famiglia delle Anacardiaceae, è un olio essenziale ottenuto per idrodistillazione da foglie, frutti o dall'essudato del tronco (mastice). Il mastice (il più noto dei fitocomplessi) è risultato essere efficace verso vari disturbi a livello gastrico e contro l'Helicobacter Pylori ed inoltre di avere attività antibatterica ed antifungina. I principali costituenti degli oli ottenuti dal genere Pistacia sono i monoterpeni che presentano proprietà preventive e chemioterapiche. Oggetto di studio di questi tre anni di dottorato è un olio essenziale di Pistacia lentiscus, ottenuto per idrodistillazione da foglie e ramoscelli, testato su una linea cellulare di adenocarcinoma del colon (cellule LoVo), una di adenocarcinoma dell'ovaio (cellule 2008) e la loro variante cis-platino resistente (cellule C13*) ed una linea di fibroblasti umani (cellule HFFF2). Il test dell'MTT dimostra che dopo 3 ore di trattamento il fitocomplesso, alla dose di 150 µg/ml circa, è in grado di inibire la proliferazione di tutte le linee di adenocarcinoma. Dopo 24 ore di trattamento, invece, l'IC50 risulta 3 volte inferiore per le linee LoVo e 2008. Per contro, sulla linea non tumorale di fibroblasti umani il fitocomplesso si dimostra attivo solo dopo 72 ore di trattamento. L'analisi mediante Western blotting conferma la capacità dell'olio di ridurre la crescita cellulare delle cellule di adenocarcinoma diminuendo in maniera dose-dipendente l'espressione delle p-ERK, MAP chinasi indotte da stimoli mitogeni. Mediante microscopia ottica, inoltre, si può apprezzare come le cellule trattate risultino più piccole, rotondeggianti e meno "luminose", ad indicare una loro minore vitalità . Approfondendo i meccanismi d'azione dell'olio (mediante l'utilizzo di annexina V e ioduro di propidio) si osserva che il trattamento è in grado di attivare nelle cellule tumorali meccanismi di morte cellulare programmata. E' noto che i ROS sono degli importanti mediatori della risposta agli stress cellulari, in particolare attraverso la mediazione della perdita del potenziale della membrana mitocondriale, e che, a monte della produzione di ROS, c'è un blocco della catena respiratoria che porta ad un concomitante aumento del potenziale della membrana mitocondriale. Le analisi di questo, mediante Rodamina 123, e della generazione di ROS, utilizzando H2DCF-DA, dimostrano la capacità dell'olio di attivare la via apoptotica mitocondriale. Il trattamento è quindi anche in grado di indurre un'alterazione nel gradiente protonico ed un'interruzione del passaggio di elettroni attraverso la catena respiratoria causando così anche la diminuzione della produzione di ATP. Nell'attivazione del processo apoptotico le caspasi giocano un ruolo cruciale. Questi enzimi, a seconda della specificità di substrato e del target, possono essere raggruppati in "niziatori" o "effettori" di apoptosi, tra questi ultimi la caspasi 3 risulta essere sicuramente la più importante. I nostri risultati indicano che l'olio di Pistacia lentiscus è in grado di attivare la morte cellulare programmata attraverso la via caspasi-dipendente. Infatti, dopo 3 ore di trattamento e 21 di incubazione, i livelli della caspasi 3 si dimostrano più alti rispetto a quelli del controllo, specialmente per la dose maggiore adottata. E' stata effettuata anche un'analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare che ha permesso di osservare come il fitocomplesso induca un arresto del ciclo in fase G2/M in maniera dose-dipendente. Questo arresto avviene attraverso una diminuzione dei livelli citoplasmatici di ciclina B1, specialmente nelle linee di adenocarcinoma ovarico, e agendo sui livelli di tubulina acetilata e sui meccanismi di polimerizzazione/depolimerizzazione dei microtubuli.File | Dimensione | Formato | |
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