Basi metaboliche per la tessuto-specificità delle sindromi miopatiche da deplezione del DNA mitocondriale

Mitochondrial DNA (mtDNA), in contrast to nuclear DNA, undergoes a continuous turnover and replicates throughout the cell cycle. Cells need a balanced supply of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) to replicate and repair their DNA properly. Mammalian cells contain two separate pools of dNTPs, a cytosolic-nuclear pool and a mitochondrial pool, which are in communication and are synthesized through two pathways: cytosolic de novo synthesis and the salvage pathway (two parallel pathways, one cytosolic and one mitochondrial). In proliferating cells dTTP is predominantly provided by the S-phase specific de novo synthesis catalyzed by ribonucleotide reductase (RNR) in the form R1/R2 and secondarily by the cytosolic salvage pathway, where thymidine is phoshporylated into dTMP by the action of cytosolic thymidine kinase (TK1). Inside cells, TK1 has a 100-fold higher activity compared to mitochondrial thymidine kinase (TK2), this is why TK1 has a main role in the salvage of thymidine during S-phase. In the synthesis of dTTP anabolic reactions are counterbalanced by catabolic ones, catalyzed by thymidine phosphorylase (TP), that degrades thymidine to deoxyuridine, and by the cytosolic (cdN) and the mitochondrial (mdN) deoxynucleotidases, that convert dTMP to thymidine building up a regulatory substrate cycle with TK1 and TK2 respectively. Both TK1 and the R2 subunit of RNR are cell-cycle regulated and undergo proteolytic degradation in late mitosis. In non-cycling cells de novo synthesis is reduced to about 2% as compared to the rate of synthesis during proliferation and depends on R1/p53R2, while TK2 is the only enzyme responsible for the salvage synthesis of dTTP. As a result of these changes both cytosolic and mitochondrial pools are ten-fold lower in quiescent mammalian cells. Thus dNTPs production changes in parallel with the reduced consumption of DNA precursors, limited to mtDNA synthesis (a small percentage compared to the total DNA content of the cell). In this context the roles of TK2 and p53R2 become more relevant in non-cycling cells and this is confirmed by the existence of mtDNA depletion syndromes (MDS) linked to mutation in either TK2 or p53R2 genes. MDS are a group of autosomal recessive disorders, clinically heterogeneous and characterized by reduced copy numbers of mtDNA. MDS show marked tissue-specificity and affect post-mitotic cells. Mutations in genes involved in dNTP metabolism or in mtDNA replication have been found to cause MDS. Genetic inactivation of TK2 or p53R2 is linked to myopathic MDS, which primarily affects skeletal muscle. The pathology is attributed to a dNTP pools imbalance in the affected tissues. The aim of my work is to explore the metabolic mechanisms which could account for the muscle vulnerability in TK2 and p53R2 deficiencies. In the first part I studied quiescent cultures of TK2-mutated skin fibroblasts isolated from two patients affected by myopathic MDS. My purpose was to assess if cell types not affected by TK2 mutations are endowed with some mechanism of compensation that buffers the effects of the genetic deficiency. In the second part I studied differentiated culture of muscle cells in order to understand what makes muscle so vulnerable to genetic inactivation of TK2 or p53R2. By comparing these two cellular models we aimed to find out differences that could account for the tissue-specificity observed for the mutations in these genes. In cycling cells dTTP synthesis is not affected by TK2- or p53R2-deficiency because dTTP is primarily synthesized in the cytosol by R1/R2 and TK1. For this reason I performed my experiments in quiescent or differentiated cultures, where dTTP pool depends exclusively on TK2 activity and R1/p53R2 de novo synthesis. Quiescence in skin fibroblasts can be obtained by shifting the medium of confluent cultures from 10% to 0.1% serum and keeping them in these conditions for at least 10 days before performing the experiments. I studied quiescent cultures of two lines of skin fibroblasts obtained from patients (Pa and Pb) that are compound heterozygotes and harbored two different pairs of TK2 mutations (T77M/R161K and R152G/ K171del). I compared them with two wild-type lines coming from biopsies obtained from healthy subjects of corresponding ages. I measured TK2 enzymatic activity in cellular extracts. Patient cells contained 5% (Pa) or 40% (Pb) residual TK2 activity. However, the marked reduction in TK2 activity did not affect the dNTP pools: both cytosolic and mitochondrial dTTP pools were unchanged and also the overall composition of dNTP pools was normal. Looking for possible mechanisms that could compensate TK2 deficiency in the mutant lines, I measured the enzymatic activities of thymidine phosphorylase, and the two deoxynucleotidases cdN and mdN and I evaluated the expression of the three RNR subunits both by real-time PCR and western blot analysis. I did not find any sign of metabolic adaptation in the mutated cells, such as a down-regulation of catabolic pathways or an up-regulation of de novo R1/p53R2 synthesis. When I compared the dynamics of the dTTP pool in mutated and control fibroblasts by incubating the cells with radioactive thymidine, in striking contrast to the low TK2 activity measured in cell extracts, the mutated cells phoshporylated thymidine as efficiently as the wild-type cells. By pulse-chase experiment I compared dTTP turnover in control and patient cells and I found that the control cells in vivo synthesized dTTP with the same efficiency as the mutant cells, i.e. at a rate 10-fold lower than that observed in TK2 enzymatic assays. The expression of TK2 increases when wild-type cultured fibroblasts become quiescent (Rampazzo et al., 2007), but the enzyme does not work at its full potential. These data show that a small fraction of such potential TK2 activity is sufficient to maintain the dTTP pools of wild-type fibroblasts. In the mutants, however, the in situ (in cultured cells) and in vitro (in protein extracts) rates of TK2 activity coincide, and by fully exploiting their TK2 complement, the cells preserve their dTTP pools, which might explain the lack of mtDNA depletion in these cells (Frangini et al., 2009). C2C12 mouse myoblasts can be induced to differentiate by shifting them to a 2% horse serum medium (differentiation medium): myoblasts become post-mitotic myocytes and fuse into multinucleated cells called myotubes, which exhibit spontaneous contraction. Differentiated cultures of C2C12 cells contain a significant fraction of mononucleated cells whose dNTP pool sizes and enzymatic setup differ from those of multinucleated myotubes. I set up a protocol for the separation of myotubes and myoblasts from differentiated cultures. The purity of the fractions was evaluated by measuring TK1 activity (expected to be present in mononucleated cells only) and the expression of muscle-specific proteins, myogenin and myosin (characteristic of myotubes). The latter parameter was also an index of the degree of differentiation within experiments. Thanks to this procedure I obtained a fraction of differentiated myotubes with a minimal contamination by mononucleated unfused cells. I first characterized the dNTP metabolism in these cells by measuring the expression of the key anabolic and catabolic enzymes, the activity of the enzymes of dTTP salvage synthesis and the composition of the four total dNTP pools. I focused on all the changes that take place at the onset of a post-mitotic status. A clear difference between muscle cells and fibroblasts was an exceedingly low activity of TK2 in the former that did not increase at differentiation (in fibroblasts at the onset of quiescence there is a 3-fold induction). This cellular model was compared to mouse skeletal muscle by microarray analysis. The results show a strict similarity between the expression profiles of the enzymes of dNTP metabolism. So, we decided to use this cellular system to reproduce in vitro the myopathic phenotype of MDS linked to TK2 or p53R2 deficiencies. I set up a protocol for transfection with Stealth siRNA (Invitrogen) that combines transfection and differentiation and obtained 80-90% and 60-70% silencing for p53R2 and TK2, respectively. As a result of mitochondrial biogenesis during myogenesis, differentiating C2C12 cells usually show a 7-8 fold mtDNA expansion with differentiation. The evaluation of the mtDNA content by quantitative realtime PCR revealed 50% mtDNA depletion in TK2-silenced myotubes at only 4 days of differentiation, while in p53R2 silenced cells the first sign of mtDNA depletion appeared at the 8th day of differentiation. Also TK2-/- (Zhou et al., 2008; Akman et al., 2008) and p53R2-/- (Kimura et al., 2003) mice differ for the time of onset of the pathological phenotype, the former show the first symptoms 7 days after birth, while the latter only after 8 weeks. Even if these are preliminary experiments, we can say that we obtained a cellular model for myopathic MDS that showed mtDNA depletion in vitro. We did not find indications for a mechanism of transcriptional compensation for TK2 and p53R2 deficiencies in the expression of key enzymes of dNTP metabolism. The preliminary pool determination in the silenced myotubes do not allow to draw conclusions on the molecular basis of the observed phenotype. The experiments must be repeated. In particular the transfection procedure decreases the efficiency of myotube purification, affecting the reproducibility between experiments. We need to improve the procedure of sample preparation for the extraction of nucleotide pools from the transfected muscle cells, in order to reduce the variability in dNTP content. More investigation are also needed to clarify the molecular phenotype of silenced myotubes.

Il DNA mitocondriale (mtDNA), a differenza di quello nucleare, è sottoposto ad un continuo turnover e si replica lungo tutto il ciclo cellulare. Affinché la sintesi e la riparazione del DNA avvengano correttamente è necessario che vi sia un apporto bilanciato di deossiribonucleosidi trifosfato (dNTP). Le cellule di mammifero contengono due pool di dNTP separati, uno citosolico e uno mitocondriale, che si trovano in comunicazione tra loro e il cui mantenimento avviene attraverso due vie di sintesi: la via de novo e la via di recupero citosolica e mitocondriale. Nelle cellule proliferanti il dTTP è sintetizzato principalmente nel citosol attraverso la via de novo il cui enzima chiave è la ribonucleotide reduttasi (RNR), in fase S costituita dalle subunità R1/R2, e in misura minore dalla via di recupero di deossiribonucleosidi, dove la timidina viene fosforilata a dTMP dalla timidina chinasi citosolica (TK1). All’interno delle cellule la TK1 ha un’attività cento volte superiore a quella della timidina chinasi mitocondriale (TK2) e perciò il suo ruolo è predominante nella sintesi di recupero della timidina in fase S. Le vie anaboliche sono bilanciate dalle vie cataboliche catalizzate dalla timidina fosforilasi (TP), che degrada la timidina a deossiuridina, e dalle deossinucleotidasi citosolica (cdN) e mitocondriale (mdN), che convertono il dTMP in timidina costituendo un substrate cycle regolativo rispettivamente con la TK1 e la TK2. Sia la subunità R2 della RNR che la TK1 sono regolate con il ciclo cellulare e subiscono una degradazione proteolitica in tarda mitosi. Nelle cellule non ciclanti la sintesi de novo si riduce ad un 2% di quella presente in condizioni di proliferazione e dipende da R1/p53R2, mentre la timidina chinasi mitocondriale, TK2, è l’unico enzima responsabile della fosforilazione della timidina nella sintesi di recupero del dTTP. Il risultato di questa riorganizzazione comporta un ridimensionamento dei pool nucleotidici citoplasmatici e mitocondriali, che si riducono entrambi di circa 10 volte nelle cellule di mammifero quiescenti. In questo modo le cellule ricalibrano la produzione dei dNTP in funzione del ridotto consumo di precursori, limitato alla replicazione del mtDNA (una piccola percentuale rispetto al DNA totale). In questo contesto i ruoli della TK2 e di p53R2 assumono notevole rilevanza e ciò è dimostrato dal fatto che mutazioni in questi enzimi causano patologie caratterizzate da deplezione del mtDNA (sindromi da deplezione del mtDNA o MDS). Esse rappresentano una classe di malattie mitocondriali ereditarie, a trasmissione autosomica recessiva, clinicamente eterogenea e caratterizzata da una riduzione quantitativa del numero di copie di mtDNA e sono causate da mutazioni in geni nucleari codificanti proteine coinvolte nel metabolismo dei dNTP o nella replicazione del mtDNA. Le MDS sono caratterizzate da un’elevata tessuto-specificità e interessano tessuti differenziati, dove le cellule non sono in attiva proliferazione. L’inattivazione genica della TK2 o di p53R2 è correlata all’insorgenza di una forma miopatica di MDS, in cui il muscolo è il principale tessuto colpito. La patologia è stata aattribuita ad uno sbilanciamento dei pool dei dNTP nei tessuti affetti. Lo scopo del mio lavoro di dottorato è quello di individuare le basi molecolari che determinano la tessuto-specificità nelle MDS miopatiche dovute a mutazioni della TK2 o di p53R2. Nella prima parte mi sono dedicata allo studio di colture quiescenti di fibroblasti di pelle provenienti da pazienti con deficienza della TK2. Il mio obiettivo era quello di capire se nei tipi cellulari non colpiti dalla miopatia, come i fibroblasti, ci fossero dei meccanismi di compensazione in grado di tamponare gli effetti di una ridotta attività della timidina chinasi mitocondriale. Nella seconda parte mi sono dedicata allo studio di un modello di cellule muscolari differenziate in coltura, per cercare di individuare che cosa rende il tessuto muscolare così vulnerabile all’inattivazione di TK2 e p53R2. Nel confronto di questi due modelli cellulari abbiamo mirato all’individuazione di elementi divergenti che potessero costituire punti di fragilità del muscolo rispetto a una deficienza genetica delle due proteine. In cellule proliferanti la deficienza della TK2 o di p53R2 è ininfluente per il mantenimento del pool mitocondriale del dTTP, prodotto principalmente nel citosol attraverso l’attività di R1/R2 e della TK1. Di conseguenza ho eseguito tutti gli esperimenti in colture quiescenti o differenziate, in cui il mantenimento del pool del dTTP è garantito dall’attività della TK2 e della via de novo catalizzata da R1/p53R2. In questo contesto i ruoli della TK2 e di p53R2 assumono notevole rilevanza e ciò è dimostrato dal fatto che mutazioni in questi enzimi causano patologie caratterizzate da deplezione del mtDNA (sindromi da deplezione del mtDNA o MDS). Esse rappresentano una classe di malattie mitocondriali ereditarie, a trasmissione autosomica recessiva, clinicamente eterogenea e caratterizzata da una riduzione quantitativa del numero di copie di mtDNA e sono causate da mutazioni in geni nucleari codificanti proteine coinvolte nel metabolismo dei dNTP o nella replicazione del mtDNA. Le MDS sono caratterizzate da un’elevata tessuto-specificità e interessano tessuti differenziati, dove le cellule non sono in attiva proliferazione. L’inattivazione genica della TK2 o di p53R2 è correlata all’insorgenza di una forma miopatica di MDS, in cui il muscolo è il principale tessuto colpito. La patologia è stata aattribuita ad uno sbilanciamento dei pool dei dNTP nei tessuti affetti. Lo scopo del mio lavoro di dottorato è quello di individuare le basi molecolari che determinano la tessuto-specificità nelle MDS miopatiche dovute a mutazioni della TK2 o di p53R2. Nella prima parte mi sono dedicata allo studio di colture quiescenti di fibroblasti di pelle provenienti da pazienti con deficienza della TK2. Il mio obiettivo era quello di capire se nei tipi cellulari non colpiti dalla miopatia, come i fibroblasti, ci fossero dei meccanismi di compensazione in grado di tamponare gli effetti di una ridotta attività della timidina chinasi mitocondriale. Nella seconda parte mi sono dedicata allo studio di un modello di cellule muscolari differenziate in coltura, per cercare di individuare che cosa rende il tessuto muscolare così vulnerabile all’inattivazione di TK2 e p53R2. Nel confronto di questi due modelli cellulari abbiamo mirato all’individuazione di elementi divergenti che potessero costituire punti di fragilità del muscolo rispetto a una deficienza genetica delle due proteine. In cellule proliferanti la deficienza della TK2 o di p53R2 è ininfluente per il mantenimento del pool mitocondriale del dTTP, prodotto principalmente nel citosol attraverso l’attività di R1/R2 e della TK1. Di conseguenza ho eseguito tutti gli esperimenti in colture quiescenti o differenziate, in cui il mantenimento del pool del dTTP è garantito dall’attività della TK2 e della via de novo catalizzata da R1/p53R2. Nei fibroblasti la quiescenza è stata indotta in colture confluenti riducendo la percentuale di siero nel mezzo di coltura dal 10% allo 0.1% e mantenendo le cellule in condizioni quiescenti per 10 giorni, prima di eseguire gli esperimenti. Ho studiato colture quiescenti di due linee di fibroblasti di pelle provenienti da pazienti (Pa e Pb), genotipicamente distinti, portatori di mutazioni in eterozigosi nel gene della TK2 (T77M/R161K e R152G/ K171del). Le due linee di pazienti sono state confrontate con due linee di fibroblasti di controllo (Ca e Cb) provenienti da biopsie di soggetti sani di età corrispondente. Ho misurato l’attività enzimatica della TK2 negli estratti cellulari. Le cellule dei pazienti mostrano una notevole riduzione di attività TK2, gli estratti Pa hanno un’attività TK2 più bassa (circa il 5% dei controlli) rispetto agli estratti Pb (circa il 40% dei controlli). Tuttavia a questa riduzione di attività enzimatica della TK2 non corrisponde uno sbilanciamento dei pool dei dNTP: le dimensioni dei pool citosolici e mitocondriali del dTTP sono paragonabili a quelle dei controlli e anche la composizione dei pool dei quattro dNTP non subisce modificazioni. Ricercando possibili meccanismi che potessero compensare la deficienza della TK2 nelle linee mutanti, ho misurato le attività enzimatiche della timidina fosforilasi e delle deossinucleotidasi e l’espressione delle tre subunità della RNR, valutata a livello di mRNA mediante real-time PCR e a livello proteico mediante western blot. Nelle linee mutate non ho ritrovato meccanismi di adattamento metabolico quali una riduzione delle vie cataboliche o una maggior dipendenza dalla via de novo di R1/p53R2. Confrontando le dinamiche del pool del dTTP nei mutanti e nei controlli, in esperimenti di marcatura con timidina triziata, ho osservato che nonostante la ridotta attività TK2 i mutanti fosforilano il precursore con la stessa efficienza dei controlli. Dall’analisi del turnover del dTTP, attraverso esperimenti di pulse-chase, risulta che le cellule di controllo sintetizzano il dTTP in situ con la stessa efficienza delle cellule mutate, ad un tasso 10 volte inferiore a quello misurato nei saggi enzimatici eseguiti negli estratti proteici. L’espressione della TK2 aumenta in fibroblasti di pelle wild-type quiescenti (Rampazzo et al., 2007), ma l’enzima sembra lavorare a livelli inferiori alle sue potenzialità. Dai risultati ottenuti in questo mio lavoro, una piccola percentuale dell’attività potenziale della TK2 sembra venga effettivamente utilizzata per mantenere il pool del dTTP nei fibroblasti wild-type. Nelle cellule mutanti, invece, i tassi di fosforilazione in vitro (in estratti proteici) e in situ (in colture cellulari) non differiscono. Si potrebbe pensare che queste cellule siano in grado di mantenere adeguati livelli del pool del dTTP sfruttando completamente la loro attività TK2 residua. Ciò spiegherebbe l’assenza di deplezione del mtDNA riscontrata in queste linee mutate (Frangini et al., 2009). Nella linea di mioblasti murini C2C12 si può indurre il differenziamento sostituendo il terreno di coltura con un mezzo al 2% di siero di cavallo (terreno di differenziamento) : i mioblasti diventano miociti post-mitotici e si fondono in sincizi multinucleati detti miotubi, che esibiscono attività contrattile. Tuttavia, colture differenziate di C2C12 contengono una frazione significativa di cellule mononucleate, in cui la quantità di dNTP e l’assetto enzimatico differiscono rispetto ai miotubi differenziati. Ho quindi messo a punto un protocollo che permette di separare la frazione di miotubi da quella di mioblasti a partire da una coltura differenziata. La purezza delle frazioni è stata valutata misurando l’attività enzimatica della TK1 (marcatore di cellule proliferanti) e l’espressione di proteine muscolo-specifiche, la miogenina e la miosina, da cui si può stimare il grado di differenziamento. Grazie a questo protocollo di purificazione sono riuscita ad ottenere una frazione di miotubi differenziati in cui la presenza di cellule mononucleate non fuse è minimizzata. Ho quindi svolto una caratterizzazione dei miotubi misurando l’espressione degli enzimi coinvolti nelle vie biosintetiche dei deossinucleotidi, l’attività enzimatica degli enzimi della sintesi di recupero del dTTP e la composizione dei pool cellulari totali dei quattro dNTP. Ho preso in esame in particolare le modificazioni che si instaurano con il differenziamento dei mioblasti in miotubi, alla ricerca di eventuali differenze rispetto a quanto già osservato in fibroblasti di pelle al passaggio dalla proliferazione alla quiescenza. La differenza che spicca maggiormente da questo confronto è la presenza di un’attività molto bassa della TK2, che non aumenta con il differenziamento (nei fibroblasti che entrano in quiescenza aumenta invece di circa 3 volte). Dal confronto del modello mioblasti/miotubi con il muscolo scheletrico, effettuato in collaborazione con un altro laboratorio mediante analisi di microarray, è emersa una stretta similarità tra i profili di espressione dei geni del metabolismo dei dNTP nei miotubi e nel muscolo. Abbiamo quindi deciso usare questo modello cellulare per simulare in vitro le MDS miopatiche correlate a mutazioni di p53R2 e della TK2. Ho messo a punto un protocollo di trasfezione con siRNA Stealth (Invitrogen) che combinasse trasfezione e differenziamento ottenendo un silenziamento dell’80-90% per p53R2 e del 60-70% per la TK2. Nelle C2C12 in coltura il differenziamento determina un’espansione del numero di copie del mDNA di circa 7-8 volte rispetto ai mioblasti proliferanti, in conseguenza della stimolazione della biogenesi mitocondriale che accompagna la miogenesi. La quantificazione del mtDNA mediante real-time PCR quantitativa nei miotubi silenziati per la TK2 mostra una deplezione di circa il 50% a soli 4 giorni di differenziamento; quando è p53R2 ad essere silenziata, gli effetti sul mtDNA iniziano a manifestarsi all’ottavo giorno di differenziamento. Una differenza temporale nella manifestazione fenotipica è stata osservata anche tra i topi TK2-/- (Zhou et al., 2008; Akman et al., 2008) e p53R2-/- (Kimura et al., 2003), i primi iniziano a mostrare sintomi a 7 giorni dalla nascita, mentre i secondi a 8 settimane. Da questi esperimenti preliminari di silenziamento possiamo affermare di aver ottenuto un modello cellulare per le MDS miopatiche in cui si osserva deplezione del mtDNA. Non emergono indicazioni a favore di un meccanismo di compensazione trascrizionale per la deficienza di p53R2 e TK2 nell’espressione dei geni del metabolismo dei dNTP. Le prime determinazioni dei pool dei dNTP nelle colture silenziate non ci hanno permesso finora di chiarire le basi molecolari del fenotipo osservato. Gli esperimenti andranno sicuramente ripetuti. In particolare il procedimento della trasfezione determina una riduzione dell’efficienza di purificazione dei miotubi trasfettati, minando la riproducibilità dei risultati tra esperimenti diversi. Sarà necessario introdurre dei miglioramenti nella preparazione dei campioni per l’estrazione dei pool nucleotidici dalle cellule trasfettate per avere una determinazione più affidabile del loro contenuto di dNTP. Prevediamo che ulteriori indagini ci consentiranno di chiarire meglio il fenotipo di questi silenziamenti e di mettere in luce le relazioni tra la deplezione o la mancata espansione del mtDNA durante il differenziamento e la carenza di precursori.