Coinvolgimento della proteinchinasi CK2 nella resistenza all'imatinib in cellule di leucemia mieloide cronica

Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disorder of hematopoietic stem cells, characterized by clonal expansion of a primitive pluripotent stem cell with the consequence of the increasing number of granulocytes in the blood. A hallmark of CML is the Philadelphia chromosome (Ph+), originated from a reciprocal chromosomal translocation t(9;22)(q34;q11), that leads to the formation of the BCR/ABL1 fusion gene, which encodes for the constitutively active Bcr/Abl tyrosine kinase oncoprotein. Imatinib (STI-571) selectively targets the Bcr/Abl oncoprotein and represents now the standard therapy in this disease. Despite its great efficacy, imatinib-resistance has emerged as a significant clinical issue. The cell line LAMA84 is a model of CML. In this thesis, we used two variants of LAMA84 cells: one is unable to survive and grow in presence of imatinib (LAMA84-S), while the other can grow in presence of 1.5 ÎμM imatinib (LAMA84-R). The aim of this work was the analysis of the protein kinase CK2 in the LAMA84-S/R cell lines. Protein kinase CK2 is a ubiquitously and constitutively active Ser/Thr kinase, which phosphorylates several substrates implicated in key processes of cell life. CK2 is mostly present as a heterotetrameric structure composed of two catalytic α (44 kDa) and/or α' (38 kDa) and two regulatory subunits β (25 kDa). The analysis by western blotting of the Bcr/Abl protein-level in various cellular lysates of LAMA84-S and LAMA84-R cells shows that the imatinib-resistance in these cells is associated with an amplification of BCR/ABL1 gene and an overexpression of Bcr/Abl. Moreover, the analysis of the CK2 cellular protein-level points up, unexpectedly, a kinase expression about two-fold higher in imatinib-resistant than in imatinib-sensitive cells. Both CK2α and CK2β subunits, but not CK2α', are upregulated. The activity of the CK2 holoenzyme was then tested on the β-casein substrate or on the specific synthetic peptide R3AD2SD5, while that of the monomeric CK2α was detected by an in-gel kinase assay. Consistent with the CK2 protein-level, the activity of both holoenzyme and monomeric CK2α is higher in LAMA84-R cells as compared to LAMA84-S cells. The immunoprecipitation of Bcr/Abl from cellular lysates of LAMA84-S/R cells shows that CK2 co-immunoprecipitates with Bcr/Abl only in imatinib-resistant cells. This outcome is also supported by the presence of Bcr/Abl in the CK2α-immunoprecipitates obtained from the same cellular lysates, and analyzed by western blotting and mass spectrometry. Since the relationship between CK2α and Bcr/Abl suggests a potential phosphorylation of CK2 by this tyrosine kinase, an immunoprecipitation with anti-phospho-tyrosine (p-Tyr) antibody was performed from cellular lysates of LAMA84-S/R cells and the western-blotting analysis of the immunoprecipitates reveals the presence of CK2 only in LAMA84-R samples. CK2α Tyr-phosphorylation increases if the cells are treated with the protein tyrosine phosphatase, pervanadate. To prove if CK2 Tyr-phosphorylation is mediated by CK2α autophosphorylation, as elsewhere described, or by Bcr/Abl catalyzed phosphorylation, LAMA84-R cells were treated for 24h with inhibitors specific for CK2 or Bcr/Abl. CK2α was immunoprecipitated from treated cells and analyzed for its p-Tyr immunostaining. While CX-4945, a selective inhibitor of CK2, currently in phase I of clinical trial in patients with solid tumors, does not affect p-Tyr-CK2α-phosphorylation, the Abl-inhibitor imatinib reduces the Tyr-phosphorylation of CK2α, suggesting that Bcr/Abl is most likely involved in CK2α tyrosine-phosphorylation in LAMA84-R cells. To examine the potential effect of CK2 or Bcr/Abl activities on the two kinase interaction, LAMA84-R cells were treated with CX-4945, imatinib, the Abl allosteric inhibitor GNF-2, and the potent non-specific kinase inhibitor staurosporine. Only the treatment with the CK2 inhibitor CX-4945 strongly reduces the interaction between the two kinases. To highlight the role of CK2 during cell proliferation, LAMA84-S/R cells were treated for 48 h with different concentrations of CX-4945 and their viability was measured using the MTT assay. The data suggest that the viability of both LAMA84-R and LAMA84-S cells decreases at increasing concentration of CX-4945, being the inhibitor more effective on the imatinib-resistant than the imatinib-sensitive cells. Experiments performed using combined CX-4945 and imatinib, demonstrated that while the viability of LAMA84-S cells treated with imatinib alone or in combination with CX-4945 is reduced in the same manner, the inhibition of CK2 activity by CX-4945 sensitizes resistant LAMA84 cells to low imatinib concentrations. Finally, the occurrence of possible interactions between CK2 and other proteins was analyzed in imatinib-resistant cells. To this purpose, CK2α was immunoprecipitated from LAMA84-R cellular lysates and the co-immunoprecipitation of CK2 in the immunocomplexes was tested by in vitro kinase assays in the presence of [γ33P]ATP. The SDS-PAGE analysis of the radioactive samples evidenced a band, of about 35-38 KDa, incorporating 33P-radioactivity comparable to that corresponding to CK2β subunit. The mass spectrometry analysis demonstrated that the band corresponds to the subunit j of the eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3j) and the phosphorylated site was identified as the Ser127 (Q-E-E-S-D-L-E). The mass spectrometry analysis of CK2α-immunoprecipitates highlighted the presence of other eIF3 subunits, such as b, f, l, g, h, k. The IF3b-immunoprecipitates obtained from LAMA84-R lysates contained both CK2α and CK2β subunits and the in vitro phosphorylation of eIF3b-immunoprecipitates in the presence [γ33P]ATP demonstrated that also eIF3b is a substrate of CK2.

La leucemia mieloide cronica (CML) è una malattia mieloproliferativa delle cellule ematopoietiche staminali, caratterizzata da un'espansione clonale di cellule staminali pluripotenti progenitrici con il conseguente incremento dei granulociti nel sangue. Un marcatore della CML è il cromosoma Philadelphia (Ph+), originato dalla traslocazione reciproca t(9;22)(q34;q11), che dà  origine al gene di fusione BCR/ABL1, codificante per l'oncoproteina Bcr/Abl, una tirosin-chinasi costitutivamente attiva. L'imatinib (STI-571) colpisce selettivamente l'oncoproteina Bcr/Abl e rappresenta la terapia standard d'inizio per questa patologia. Nonostante la sua grande efficacia, la resistenza all'imatinib è emersa come un significativo problema clinico. La linea cellulare LAMA84 è un modello della CML. In questa tesi, abbiamo usato due varianti di cellule LAMA84: una è incapace di sopravvivere e crescere in presenza di imatinib (LAMA84-S), mentre l'altra può crescere in presenza di 1,5 ÎμM imatinib (LAMA84-R). Lo scopo di questo lavoro è stato l'analisi della proteinchinasi CK2 nelle cellule LAMA84-S/R. La proteinchinasi CK2 è un Ser/Thr-chinasi ubiquitaria e costitutivamente attiva, che fosforila svariati substrati implicati in processi chiave della vita cellulare. CK2 presenta generalmente una struttura eterotetramerica composta da due subunità catalitiche α (44 kDa) e/o α' (38 kDa) e due subunità regolatrici β (25 kDa). L'analisi mediante western blot dei livelli proteici di Bcr/Abl in diversi lisati cellulari di cellule LAMA84-S e LAMA84-R mostra che la resistenza all'imatinib in queste cellule è associata all'amplificazione del gene BCR/ABL1 e alla sovraespressione di Bcr/Abl. Inoltre, l'analisi dei livelli proteici intracellulari di CK2 evidenzia, inaspettatamente, un'espressione della chinasi di circa due volte maggiore nelle cellule resistenti all'imatinib rispetto a quelle sensibili. Entrambe le subunità CK2α e CK2β, ma non CK2α', sono sovraespresse. L'attività  dell'oloenzima CK2 è stata saggiata sul substrato β-caseina o sul peptide specifico sintetico R3AD2SD5, mentre quella di CK2α monomerica è stata rilevata mediante un in-gel kinase assay. Coerentemente con il livello proteico di CK2, l'attività  sia dell'oloenzima che di CK2α monomerica è maggiore nelle cellule LAMA84-R rispetto alle cellule LAMA84-S. L'immunoprecipitazione di Bcr/Abl da lisati cellulari di cellule LAMA84-S/R mostra che CK2 immunoprecipita con Bcr/abl solo nelle cellule resistenti all'imatinib. Questo dato è supportato anche dalla presenza di Bcr/Abl negli immunoprecipitati di CK2α ottenuti dai medesimi lisati e analizzati mediante western blot e spettrometria di massa. Dato che la relazione fra CK2α e Bcr/Abl suggerisce una potenziale fosforilazione di CK2 da parte della tirosin-chinasi, si è realizzata un'immunoprecipitazione con l'anticorpo anti-fosfo-tirosina (p-Tyr) da lisati di cellule LAMA84-S/R e l'analisi tramite western blot degli immunoprecipitati rileva la presenza di CK2 solo nei campioni delle LAMA84-R. La Tyr-fosforilazione di CK2α aumenta se le cellule sono trattate con l'inibitore delle tirosin-fosfatasi, pervanadato. Per provare se la Tyr-fosforilazione di CK2 è mediata dall'autofosforilazione di CK2α, come descritto altrove, o è catalizzata da Bcr/Abl, le cellule LAMA84-R sono state trattate per 24 h con inibitori specifici per CK2 o Bcr/Abl. CK2α è stata immunoprecipitata dalle cellule trattate ed è stata analizzato il suo stato di Tyr-fosforilazione mediante western blot. Mentre il CX-4945, un inibitore selettivo per CK2, ora in fase I degli studi clinici su pazienti con tumori solidi, non ha effetto sulla p-Tyr-CK2α l'imatinib riduce la Tyr-fosforilazione di CK2α, suggerendo che Bcr/Abl è maggiormente coinvolto nella fosforilazione tirosinica di CK2α nelle cellule LAMA84-R. Per esaminare il potenziale effetto di CK2 e Bcr/Abl nell'interazione delle due chinasi, le cellule LAMA84-R sono state trattate con il CX-4945, l'imatinib, l'inibitore allosterico di Abl GNF-2, e il potente inibitore chinasico non-specifico staurosporina. Solo il trattamento con l'inibitore di CK2, CX-4945, riduce l'interazione fra le due chinasi. Per sottolineare il ruolo di CK2 durante la proliferazione cellulare, le cellule LAMA84-S/R sono state trattate per 48 h con differenti concentrazioni di CX-4945 e la vitalità cellulare di entrambe le cellule LAMA84-S e LAMA84-R è stata misurata mediante il saggio MTT. I dati suggeriscono che la viabilità di entrambe le linee cellulari decresce all'aumentare della concentrazione del CX-4945, con un maggior effetto dell'inibitore nelle cellule LAMA84-R. Esperimenti effettuati mediante la combinazione di CX-4945 e imatinib, dimostrano che mentre la vitalità  delle cellule LAMA84-S trattate con l'imatinib da solo o in combinazione con il CX-4945 è ridotta in modo simile, l'inibizione dell'attività di CK2 da parte del CX-4945 sensibilizza le cellule LAMA84-R a basse concentrazioni di imatinib. Infine, la possibile interazione fra CK2 e altre proteine è stata analizzata nelle cellule resistenti all'imatinib. A questo proposito, CK2α è stata immunoprecipitata da lisati di cellule LAMA84-R e la sua attività CK2 negli immunocomplessi è stata valutata mediante un saggio chinasico in presenza di [γ33P]ATP. L'analisi mediante SDS/PAGE dei campioni reattivi evidenzia una banda, di circa 35-38 kDa, 33P-fosforilata in modo comparabile alla banda corrispondente alla subunità CK2β autofosforilata. L'analisi di spettrometria di massa ha dimostrato che la banda corrisponde alla subunità j del fattore eucariotico 3 d'inizio della traduzione (eIF3j) e il sito di fosforilazione è stato identificato nella Ser127 (Q-E-E-S-D-L-E). L'analisi di spettrometria di massa degli immunoprecipitati di CK2α ha messo in evidenza la presenza di altre subunità  di eIF3: b, f, l, g, h, k. Gli immunoprecipitati di eIF3b ottenuti da lisati di cellule LAMA84-R contengono sia CK2α che CK2β e la fosforilazione in vitro degli immunoprecipitati di eIF3b in presenza di [γ33P]ATP ha dimostrato che anche eIF3b è un substrato di CK2.