Termotolleranza, fisiologia e tassonomia di cianobatteri del Comprensorio Termale Euganeo

THERMOTOLLERANCE, PHYSIOLOGY, AND TAXONOMY OF CYANOBACTERIA FROM THE EUGANEAN THERMAL DISTRICT The muds of the hydrothermal tanks of the Euganean District (Padova, Italy) are colonized by populations of cyanobacteria, both coccoid and filamentous, which can adapt themselves to drastic and sudden changes of the water temperature. This reaserch project is part of a broader program of study on the oxygenic photoautotrophic bioglea of the Euganean Thermal District. The aim of this study is to increase knowledge about these interesting thermotolerant organisms, of which little is known from a taxonomic, physiological, as well as adaptive point of view. A research integrating the structural, functional and taxonomic aspects can provide new information on the biodiversity of these extreme environments and on the adaptative mechanisms and structural and metabolic plasticity of the organisms which colonize them. This research deals with ETS-09 and ETS-10, two of the different cyanobacteria isolated from the muds of the hydrothermal tanks of the Euganean District. The features of ETS-09 cells, derived from morphological and ultrastructural analyses, as well as its composition in photosynthetic pigments, suggested that this cyanobaterium could belong to Cyanothece, Halothece or Euhalothece genera. Like Cyanothece strains, ETS-09 was able to fix atmospheric nitrogen, since it could grow well in an organic nitrogen-free medium without effects on the growth rate and cell characteristics. Moreover, a molecular analysis led to the finding of the nifH and nifD genes, coding for subunits of the enzyme nitrogenase, in its genome. The analysis of ETS-09 cultures grown at different temperatures showed that the cyanobacterium thermotolerance was low, being it able to survive only some days at 45-47°C. The results of phylogenetic analyses, carried out using the 16S rDNA and rbcL genes as molecular markers, led to the hypothesis that ETS-09 may belong to a new genus, phylogenetically far from Cyanothece, Halothece, and Euhalothece genera. Morphological, ultrastructural and physiological analyses carried out on the second cyanobacterium, ETS-10, showed features similar to strains belonging to the genus Chroococcus. The finding of nifH and nifD genes in its genome and the ability of growing in a medium without organic nitrogen proved that also ETS-10 was able to fix nitrogen. Finally, also in this case, analyses performed on cultures grown at different temperatures showed that the thermotollerance of ETS-10 was quite limited, being the organism able to live at 45-47°C only for short time. The phylogenetic analyses, based on the 16S rDNA and rbcL genes, confirmed the initial hypothesis that the cyanobacterium belongs to the genus Chroococcus. In fact, the obtained topologies were congruent and indicated the inclusion of ETS-10 in a clade with most of the Chroococcus species. As the constructed data sets included all the Chroococcus sequences available in GenBank plus the sequences of all the Chroococcus species obtained from international culture collection, we hypothesize that ETS-10 could be a new species of the genus Chroococcus, for which we suggest the name Chroococcus aponinus.

TERMOTOLLERANZA, FISIOLOGIA E TASSONOMIA DI CIANOBATTERI DEL COMPRENSORIO TERMALE EUGANEO Sui fanghi delle vasche idrotermali del Comprensorio Termale Euganeo si sviluppano abbondanti popolazioni di cianobatteri, sia filamentosi che coccoidi, che formano spesse coperture compatte. Questi microrganismi fotosintetici ossigenici sono presenti su fanghi esposti a temperature molto variabili a seconda che la vasca che li contiene venga rifornita con acqua termale (ad elevata temperatura) o che venga mantenuta a riposo per un certo periodo. Il presente progetto di ricerca si inserisce in un più ampio programma di studio della bioglea fotoautotrofa ossigenica del Comprensorio Termale Euganeo con l’obiettivo di approfondire le conoscenze su questi interessanti microrganismi termotolleranti dei quali, ancor oggi, si conosce poco sia dal punto di vista tassonomico che fisiologico ed adattativo. Una ricerca articolata che integri aspetti strutturali, funzionali e tassonomici può fornire nuove informazioni sulla biodiversità di questi ambienti limitanti, sui meccanismi adattativi e sulla plasticità strutturale e metabolica degli organismi che li occupano. Dei diversi tipi di cianobatteri, prelevati dalla superficie del fango delle vasche idrotermali di Abano Terme, sono stati considerati in questo studio due ceppi, ETS-09 ed ETS-10 (dove ETS sta per Euganean Thermal Spring), ottenuti in coltura pura mediante la tecnica della diluizione su piastra. Le caratterisiche cellulari di ETS-09, rilevate con le iniziali indagini morfologiche ed ultrastrutturali, così come la sua composizione in pigmenti fotosintetici, suggerivano che l’organismo in esame potesse appartenere ai generi Cyanothece, Halothece o Euhalothece. ETS-09, come le specie del genere Cyanothece, era in grado di fissare l’azoto atmosferico. Questa capacità è stata dimostrata dal ritrovamento nel suo genoma dei geni nifH e NifD e dalla capacità dell’organismo di crescere in terreno privo di nutrienti azotati senza conseguenze sulla velocità di crescita e sulle caratteristiche cellulari. Dalla coltura di ETS-09 a diverse temperature è risultato che la termotolleranza di questo microrganismo non era molto elevata, portandolo a sopravvivere, per un tempo limitato, a 45°-47°C. I risultati delle analisi filogenetiche condotte utilizzando come marker molecolari i geni 16S rDNA ed rbcL sono state di particolare interesse, portando a suggerire che ETS-09 possa appartenere ad un genere nuovo filogeneticamente distante dai generi Cyanothece, Halothece ed Euhalothece a cui l’organismo era stato avvicinato inizialmente in base alle sue caratteristiche strutturali e fisiologiche. Le indagini morfologiche, ultrastrutturali e fisiologiche condotte sul secondo cianobatterio coccoide (ETS-10) hanno evidenziato caratteristiche comuni con organismi del genere Chroococcus. Il ritrovamento nel genoma dei geni nifD e nifH e la capacità di crescere in terreno privo di nutrienti azotati hanno dimostrato che anche ETS-10 era in grado di fissare N2. Dalle indagini condotte su colture allestite a diverse temperature è risultato, infine, che, analogamente al ceppo precedente, la termotolleranza di ETS-10 era piuttosto limitata permettendo al cianobatterio di sopravvivere solo per breve tempo a 45-47°C. Nel caso di ETS-10, le analisi filogenetiche condotte utilizzando come marker molecolari i geni 16S rDNA ed rbcL, hanno confermato l’iniziale ipotesi di appartenenza del cianobatterio al gnere Chroococcus. Le topologie ottenute, dopo un’analisi filogenetica utilizzando i due diversi marker, infatti, sono congruenti e indicano l’inclusione di ETS-10 in un clade comprendente la maggior parte di specie di Chroococcus. Dal momento che nei data set sono state inserite le sequenze di tutte le specie di Chroococcus disponibili in GenBank più quelle di tutte le specie di Chroococcus da me acquistate presso le banche algali, è possibile ipotizzare che ETS-10 possa appartenere ad una nuova specie del genere Chroococcus per cui si suggerisce il nome di Chroococcus aponinus.