PROTEIN PROFILES AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF SEMEN: INFLUENCE ON FROZEN-THAWED SPERMATOZOAL QUALITY IN RAMS (OVIES ARIES) AND ALPACAS (VICUGNA PACOS)

Seminal plasma (SP) is a complex biological fluid and is known to act as a nutritive-protective medium for spermatozoa suspended in it. Some of SP components are very important for sperm metabolism, as well as sperm function, survival and transport in the female reproductive tract. Remarkably little is known about biophysical and biochemical makeup of SP. Specially in camelids, the origin, composition and function of SP remain a mystery. Therefore, a series of experiments was conducted to study the biochemical composition of SP in ram and alpaca, and their possible relations with fresh semen quality and freezability. In the first experiment, as a basic study, we used two successive ejaculates collected from Sarda rams to observe the effect of ejaculate types (single and pool) on the freezability of spermatozoa. All samples cryopreserved using TRIS-citrate-egg yolk extender with 7% glycerol. We observed higher percentage of motile spermatozoa (P<0.05) with a highest motility score in post-thaw spermatozoa of pool of first and second ejaculates. In experiment two, ejaculates collected from Veneto endangered sheep breeds to study biochemical composition including Protein Profiles (PP) of SP in ejaculates and individual ram. Ejaculates were cryopreserved dividing into eight treatment groups using TRIS-based and skim milk-based extenders, and both fresh and post-thaw semen were evaluated for plasma membrane integrity with double fluorescence staining and plasma membrane architecture (phosphatidylserine translocation) with Annexin V assay along with routine semen parameters. Correlation between seminal parameters of fresh and cryopreserved semen with biochemical components of SP were statistically examined. Results of this experiment revealed ejaculate variation, more markedly, individual variation in SP composition and demonstrated that pooled (first and second) ejaculates could maintain sperm heterogeneity better when preserved with TRIS-based extender. Moreover, we observed negative but significant (P<0.01) correlation of total protein, Mg, P, and positive correlation (P<0.05) of protein bands of 75 kDa with apoptosis marker free viable sperm. In third experiment, caudal epididymal sperm collected from Veneto endangered sheep breed, were cryopreserved with TRIS- based and milk based extender to observe post-thaw sperm characteristics, and results demonstrated that post-thaw sperm quality of was inferior to that of ejaculated spermatozoa. In fourth experiment, we observed that diet could affect some SP components, especially, enzymes and energy profiles, and semen quality in terms of, semen volume, sperm concentration and sperm motility in alpaca. In experiment five, alpaca semen was cryopreserved with four types of extenders and both fresh and post-thaw semen were evaluated for plasma membrane integrity with double fluorescence staining and plasma membrane architecture (phosphatidylserine-PS translocation) with Annexin V. Results showed that TRIS based extender with 0.8% fructose could promote better post-thaw survivability of alpaca semen. we also demonstrated that there was correlation between biochemical composition of SP and both fresh and post-thaw semen quality. We found significant (P<0.01) correlation between semen viscosity, and percentage of apoptosis free sperm, Mg, P, total protein of SP. To our knowledge, this is the first report in the presence of apoptosis marker in alpaca viable sperm. However, our results confirm that biochemical composition and SP function varies with diet, ejaculate within male and between males and species. The composition of SP, therefore, is one factor that determines the suitability of individual male for semen cryopreservation and should also be taken into account in the preparation of medium during assisted reproductive techniques (ART) in order to preserve and possibly enhance post-thaw sperm fertilizing ability.

Il plasma seminale è un fluido biologico complesso ed è conosciuto come una base nutritiva e protettiva degli spermatozoi. Alcuni componenti del plasma seminale sono di particolare importanza per il metabolismo spermatico, per la funzione, sopravvivenza e trasporto di queste cellule all'interno dell'apparato riproduttore femminile. Si conosce ancora poco come migliorare da un punto di vista biochimico e biofisico il plasma seminale. Nei camelidi, in particolare, l'origine non è conosciuta. Quindi, una serie di esperimenti sono stati condotti per studiare la composizione biochimica del plasma seminale negli arieti e negli alpaca e la relazione tra le caratteristiche biochimiche e la qualità e congelabilità spermatica. Nel primo esperimento, come studio di base, si sono usati due successivi eiaculati raccolti da arieti riproduttori di razza Sarda per osservare l'influenza del tipo di eiaculato sulla congelabilità degli spermatozoi. Si è osservato una più alta % di motilità spermatica nel post-scongelamento dei campioni raggruppati di primo e secondo eiaculato. Nel secondo esperimento, sono stati considerati eiaculati raccolti da arieti di razze venete a numerosità ridottissima per studiare il profilo biochimico, compreso quello proteico. Gli eiaculati sono stati suddivisi in 8 gruppi dividendo il campione in base al diverso trattamento di diluizione e di composizione del medium (TRIS o latte scremato). Sia i campioni freschi che quelli post-scongelamento sono stati valutati considerando l'integrità di membrana plasmatica utilizzando la tecnica in fluorescenza che considera la traslocazione della fosfotidilserina (Test dell'Annessina V) capace di rilevare il grado di apoptosi cellulare. I risultati di questo esperimento indicano una variabilità della composizione del plasma seminale, anche su base individuale, e che l'eterogeneità degli eiaculati (1° vs 2°) è meglio mantenuta quando si è usato il TRIS nel medium di diluizione. Inoltre , è stato osservato una correlazione negativa significativa tra proteine totali, Mg, P e spermatozoi con assenza di risposta al test di apoptosi. Un'altra interessante relazione positiva è tra la risposta negativa al test di apoptosi e proteine con peso molecolare di 75 kDa. Nel terzo esperimento, seme epididimale, raccolto da soggetti di razze veneto a numerosità ridotta, è stato trattato con TRIS o latte scremato per osservare le caratteristiche post-scongelamento degli spermatozoi. I risultati dimostrano come le qualità spermatiche sono inferiori rispetto agli spermatozoi di eiaculato. Nel quarto esperimento, si è osservato come la dieta può influenzare i componenti del plasma seminale ed in particolare il profilo energetico ela qualità seminale (volume, concentrazione, motilità) in alpaca. Nel quinto esperimento seme di alpaca è stato trattato con 4 differenti tipi di medium di diluizione ed il miglior risultato si è ottenuto utilizzando TRIS con lo 0,8% di fruttosio. Si sono messe in evidenza numerose interessanti correlazioni tra viscosità, % di cellule negative al test dell'apoptosi, Mg, P, proteine totali. In generale si può affermare che la composizione biochimica e la funzione del plasma seminale variano con la dieta e l'eiaculato anche per lo stesso soggetto e tra specie animali. La composizione è un fattore che determina l'utilizzo del singolo soggetto per la conservazione di materiale genetico è dovrebbe esser preso in considerazione per migliorare le tecniche di preparazione di medium di mantenimento o diluizione pre-congelamento per ottimizzare le tecniche di riproduzione assistita negli animali da reddito, per migliorare i programmi di conservazione di razze in pericolo e per migliorare la capacità fertilizzante post-scongelamento.