Metodi di caratterizzazione di Scaffold per l'ingegneria Tissutale

Tissue engineering identifies procedures aimed to regenerate tissues of the body involving the seeding of cells on an appropriate support (scaffold), followed by their cultivation in appropriate bioreactors to form a new tissue to be transplanted into the patient. The scaffold, made of biodegradable or bioabsorbable material has a transitory but very important role: it must provide a physical support for cells adhesion and growth but, at the end of the process, it must be completely absorbed, leaving a newly formed tissue. Ideally, the cells necessary for scaffold seeding and colonization could be provided by the patient so that the new engineered tissue, once implanted, is devoid of immune reaction of rejection. In a longer term perspective, stem cell could be used for seeding and induced to differentiate in vitro in a particular tissue phenotype (bone, cartilage, muscle, etc.). In this thesis, attention was mainly focused on some techniques used to study structural scaffolds suitable for cell adhesion and growth. It is not superfluous to point out the fundamental importance that the material and structure of the scaffold have for the success of support function and cell growth. In particular, two specific techniques were used for analysis: scanning electron microscopy (SEM) and computed microtomography (micro-CT). Both structural and morphological analysis techniques were applied to the analysis of polymers PLLA and PCL. In the introduction the techniques have been well described, with a particular emphasis on the SEM technique that allowed analysis of polymer surfaces before and after cells implant. In the section Materials and Methods we have extensively described the techniques adopted for PLLA and PCL scaffolds preparation. The PLLA constructs are ideally addressed for use as vascular substitutes, especially if plasticized with triethyl citrate. Instead, the PCL scaffolds were prepared using an innovative technique called gel-forming and are intended for use as a substitute of bone. SEM observations of the numerous vascular PLLA scaffolds prepared show that the average porosity increases in agreement with the amount of added plasticizer. HUVEC cell adhesion to PLLA scaffolds, as evaluated by SEM observation, seems to depend mainly on the porosity, increasing in a certain range with it. PLLA scaffolds post-conditioning with fibronectin, a typical extracellular matrix protein appointed to cell adhesion, usually improves cells adhesion. PCL scaffolds assembling by gel-forming has enabled us to produce a solid matrix with uniform microporosity of interconnected pores, as demonstrated by SEM observations, fuchsin perfusion and Micro-CT analysis. The technique of PCL gel-forming allowed to realize bone substitutes of any shape and size, but a slight contraction of the final scaffold must be compensated by a 10% mold oversize. The gel-forming technique allows to incorporate various additives during the assembling, in particular a number of scaffolds were prepared in PCL/sucrose, PCL/HAp and, finally, PCL/sucrose/HAp and studied by SEM and Micro-TAC. Macropores were created in the matrix of microporous PCL after water removal of sucrose particle inclusions. A right degree of porosity facilitates cells colonization of the scaffold. The addition of hydroxyapatite increases the mechanical strength of the PCL scaffolds, but if excessive, may make them more fragile. It should also improve bone cells (osteoblasts) adhesion and growth.

Con il termine ingegneria tissutale vengono identificate le procedure indirizzate alla rigenerazione di tessuti del corpo che prevedono la semina di cellule su un supporto opportuno (scaffold) seguita dalla loro coltivazione in appositi bioreattori fino ad ottenere un nuovo tessuto da trapiantare nel paziente. Lo scaffold, realizzato in materiali biodegradabili o bioassorbibili ha quindi un ruolo transitorio ma molto importante: deve infatti fornire un supporto fisico per l’adesione e la crescita cellulare ma, alla fine del processo, deve essere completamente riassorbito lasciando il posto ad un tessuto neoformato. Idealmente le cellule necessarie alla semina e alla colonizzazione dello scaffold potrebbero essere fornite dal paziente in modo che il neotessuto formato, una volta impiantato, sia privo di reazione immunitaria di rigetto. In una prospettiva temporale più lunga, potrebbero essere utilizzate per la semina cellule di tipo staminale successivamente indotte a differenziarsi in vitro in un particolare fenotipo tissutale (osso, cartilagine, muscolo, etc.). In questo lavoro di Tesi, l’attenzione è stata focalizzata soprattutto su alcune tecniche di indagine strutturale applicate allo studio di scaffolds per ingegneria tissutale adatti alla adesione e alla crescita cellulare. Non è superfluo evidenziare, infatti, l’importanza fondamentale che il materiale e la struttura dello scaffold hanno al fine di arrivare al successo delle funzioni di supporto e di crescita cellulare. In particolare, sono state utilizzate due specifiche tecniche di analisi: la microscopia a scansione elettronica (SEM) e la microtomografia computerizzata (Micro-TAC). Le due tecniche di indagine strutturale e morfologica sono state applicate all’analisi di polimeri del tipo PLLA e PCL. Nell’introduzione sono state descritte le tecniche sopracitate, ponendo particolare enfasi alla tecnica SEM che ha permesso di analizzare le superfici polimeriche sia prima che dopo impianto di colture cellulari. Nella sezione dedicata ai materiali e metodi sono state descritte ampiamente le tecniche di preparazione degli scaffold in PLLA e in PCL. I costrutti in PLLA sono idealmente indirizzati per un utilizzo come sostituti vascolari, specialmente se elasticizzati con trietilcitrato. Invece gli scaffolds in PCL sono stati preparati utilizzando una tecnica innovativa detta gel-forming e sono indirizzati verso un utilizzo quali sostituti di osso. Le osservazioni al SEM dei numerosi scaffolds vascolari in PLLA evidenziano come la porosità media dei preparati aumenti in accordo con l’aumento della quantità di plastificante. L’adesione delle cellule HUVEC agli scaffolds realizzati in PLLA, sempre valutata mediante osservazione al SEM, sembra dipendere soprattutto dalla porosità, aumentando in un certo intervallo con essa. Il condizionamento post-assemblaggio degli scaffolds in PLLA con la fibronectina, una tipica proteina della matrice extracellulare deputata alla adesione cellulare, migliora generalmente l’adesione. L’assemblamento degli scaffolds in PCL mediante gel-forming ha permesso di produrre una matrice solida con microporosità uniforme di pori interconnessi, come dimostrato dall’osservazione al SEM, dal saggio di perfusione con fuscina e, infine, dall’analisi con Micro-TAC. La tecnica di gel-forming con PCL permette di riprodurre forma e dimensioni di qualsiasi osso, ma bisogna correggere la leggera contrazione dello scaffold finale predisponendo uno stampo sovradimensionato del 10% circa. La tecnica gel-forming permette di inglobare vari additivi durante la fase di assemblamento, in particolare sono stati preparati numerosi scaffolds in PCL/saccarosio, PCL/idrossiapatite e, infine, PCL/saccarosio/idrossiapatite che sono stati studiati con SEM e mediante Micro-TAC. Il saccarosio, di opportuna granulometria, realizza, dopo rimozione con acqua, dei macropori nella matrice microporosa del PCL che facilitano potenzialmente la colonizzazione da parte delle cellule dello scaffold. L’aggiunta di idrossiapatite aumenta la resistenza meccanica degli scaffolds in PCL ma, se eccessiva, può renderli più fragili; essa dovrebbe anche migliorare l’adesione e la crescita di cellule del tessuto osseo, in particolare degli osteoblasti. La crescita di cellule sulle varie tipologie di scaffolds in PCL, prodotte in questo lavoro, non è stata esaminata sperimentalmente.