Difetti ereditari del fattore V della coagulazione: identificazione di nuove mutazioni ed implicazioni cliniche

Introduction. Coagulation factor V (FV), which is present in plasma and platelets, is a versatile protein with both pro- and anticoagulant functions. Its essential role in the activation of prothrombin to thrombin and its interactions with several coagulation factors and inhibitors make it a central regulator of the coagulation process. Congenital FV deficiency, named also parahaemophilia, is an autosomal recessive bleeding disorder. Heterozygotes are usually asymptomatic or experience only mild bleeding, whereas homozygotes and compound heterozygotes show a mild-to-severe bleeding diathesis, depending on the residual FV level. Although first described in 1947 by Owren, the molecular basis of this defect, transmitted with an autosomal recessive trait, have begun to clarify just fifty years later. Since then, there have been described more than 80 mutations associated with a reduction in plasma levels of FV, but to date the molecular basis of many defects in FV are little known. The aim of our study was to characterize from a genetic and a molecular point of view the defect of FV in 6 subjects with severe FV deficiency. We have also studied, in this cohort of subjects, the relationship between genotype and hemorrhagic phenotype. Finally, we analyzed the correlation between plasma and platelet FV in homozygous subjects and their families. Materials and methods. After informed consent, we collected 20 ml of peripheral blood from 6 subjects with homozygous FV deficient, 19 subjects heterozygous for FV deficiency and 42 healthy members of their families. Plasma and intraplatelets FV were determined. In subjects with homozygous defect was made a screening of FV gene to identify the causative mutations of the defect. Through bioinformatic analysis and protein alignment with high sequence homology to domains A1, A2, A3 the role and importance in correlation genotype/phenotype of the aminoacid position in question was determined. Through a simplified technique of "homology modeling". We studied the possible changes in the structure of the C2 domain of FV caused by a homozygous mutation in the exon 24 using the crystallographic structure deposited for that domain. Results. Considering homozygous, heterozygous and healthy relatives a statistically linear correlation between plasma and platelets FV was found. Accordingly to the data reported in the Literature, subjects with heterozygous defect did not show a clinical hemorrhagic phenotype dissimilar from families without defect. Through the techniques of gene sequencing of the FV, we identified 3 new causative mutations, not yet listed in the database maintained by Vos et al., of serious FV defect. Conclusions. The study of families with FV defect allowed us to demonstrate the presence of a linear correlation between the levels of plasma and intraplatelets FV. The study of the factor V gene and the bioinformatics analysis of its structure, in patients with homozygous defect, allowed us to identify new mutations in the FV gene and shed light on possible new molecular mechanisms of genetic mutation associated with pathological phenotypes

Introduzione. Il fattore V (FV) della coagulazione, presente sia nel plasma che nelle piastrine, è una proteina versatile che svolge funzioni sia pro che anticoagulanti. Il difetto di FV è una malattia emorragica rara conosciuta anche col termine di paraemofilia. E’ caratterizzata da livelli molto bassi, o non misurabili, di FV antigene e attività associati ad un fenotipo clinico di tipo emorragico che varia da moderato a grave, raramente fatale. Sebbene descritto per la prima volta nel 1947 da Owren, le basi molecolari di questo difetto, trasmesso con carattere autosomico recessivo, si sono iniziate a chiarire solo cinquant’anni più tardi. Da allora sono state descritte oltre 80 mutazioni associate ad una riduzione dei livelli plasmatici di FV ma a tutt’oggi le basi molecolari di molti difetti di FV sono poco caratterizzate. Scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzare da un punto di vista genetico e molecolare il difetto di fattore V in 6 soggetti paraemofilici. Abbiamo inoltre studiato, in questa coorte di soggetti, la relazione tra genotipo e fenotipo emorragico. Infine abbiamo analizzato la correlazione tra FV plasmatico e piastrinico nei soggetti omozigoti e nei loro familiari. Materiali e metodi. Previo consenso informato abbiamo prelevato 20 ml di sangue periferico da 6 soggetti con difetto omozigote di FV, da 19 soggetti eterozigoti per il deficit di FV e da 42 loro familiari sani. Nei soggetti arruolati abbiamo determinato i livelli di FV nel plasma e nelle Plts. Nei soggetti con difetto omozigote è stato effettuato uno screeneng del gene del fattore V per identificare le mutazioni causative del difetto stesso. Attraverso analisi bioinformatiche e l’allineamento con proteine con una elevata omologia di sequenza per i domini A1, A2, A3 è stato valutato il ruolo e l’importanza nella correlazione genotipo/fenotipo della posizione aminoacidica considerata. Attraverso una tecnica semplificata di “homology modeling” abbiamo studiato la possibile variazione nella struttura del dominio C2 del FV dovuta a una mutazione omozigote presente sull’esone 24 sfruttando la struttura cristallografica depositata per tale dominio. Risultati. Considerando i soggetti omozigoti, i soggetti eterozigoti e i familiari sani abbiamo osservato una correlazione lineare, statisticamente significativa tra i livelli di FV plasmatico e FV piastrinico. In accordo con i dati riportati in letteratura, i soggetti con difetto eterozigote non presentavano un fenotipo clinico di tipo emorragico dissimile dai familiari senza difetto. Attraverso le tecniche di sequenziamento del gene del FV abbiamo identificato 3 nuove mutazioni causative, non ancora riportate nel database curato da Vos e collaboratori, del difetto grave di FV. Conclusioni. Lo studio delle famiglie con difetto di FV ci ha permesso di dimostrare la presenza di una correlazione lineare tra i livelli di FV plasmatici e intrapiastrinici. Lo studio del gene del fattore V e l’analisi bioinformatica del FV nei soggetti con difetto omozigote ci ha permesso di identificare nuove mutazioni del FV e di far luce su nuovi possibili meccanismi molecolari di mutazione genetica associati a fenotipi patologici.