The immune system of cetaceans and their interaction with dolphin morbillivirus

Immunology of marine mammals is a relatively new field of scientific studies and its monitoring plays an important role on the individual and group management of these animals, as well as an increasing value of environmental health indicator: cetaceans are viewed as environmental sentinels. The current knowledge about the immune system of cetaceans and its function is recognized as incomplete. Therefore this study aims to implement the knowledge on the immune response in normal conditions in cetaceans stranded along the Italian coastline in order to provide a base-line useful for assessing the immune status of bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) and striped dolphin (Stenella coeruleoalba), the species most found in our seas and included in some international conventions such as species with high protection. The selection of cetaceans to be included in the study was based on the availability of samples of spleen, thymus and lymph node tissue of the animals, on the way (in formalin or frozen) and the state of preservation; They have in fact been preferred tissues of animals whose sampling occurred within 48 hours of death in order to reduce as much as possible post-mortem alterations. Thereafter, animals were divided into groups on the basis of information obtained from signaling, such as species, sex, age, and environment of origin, on the outcome of virological investigations, microbiological, parasitological and toxicological, if performed, and the cause and/or the death mechanism. On the lymph node slides obtained from the formalin-fix, paraffin-embedded samples it was made basic hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining using the following antibodies: Monoclonal Mouse Anti-Human CD3 to identify T lymphocytes, Monoclonal Mouse Anti-Human CD20 for the identification of mature B lymphocytes and Monoclonal Mouse Anti-Human HLA-DR Antigen, Alpha-Chain for the identification of the major histocompatibility complex type II. It is also arranged to validate by means of the Western blotting technique antibodies used in immunohistochemistry (IHC). The use of these antibodies was valid only for humans and some domestic animals (dogs and cats), but not in the species of interest to us such as bottlenose and striped dolphins. With the antibodies mentioned above, also the lymphoid tissues of dolphins stranded along the coasts of the Canary Islands were tested and used as negative control since the death was probably due to collisions with boats/ships. Finally, a semi quantitative samples analysis was performed by acquisition of slides via slide scanner for digital pathology (D-SIGHT) and a manual count of the number of cells positive for each antibody in 10 fields to 40x magnification, considered to be representative of the entire organ, and these data were statistically analyzed using the T TEST method. Statistical analysis showed no significant correlation between the variables considered and the expression of the different lymphocyte populations. Future analysis should be aimed at analyzing the relationship between CD4+ and CD8+ cells in order to understand the effect of the major immunomodulatory pathogens, such as the dolphin morbillivirus, on sub-populations of T cells. It would also be important to compare the data obtained on the immune system with those obtained from the same samples as regards the search for environmental pollutants in order to understand the real role on the health of marine mammals present in our seas. The study was not focused only on the immune response of the guests to the different pathogens, but we concentrate our work also on the most important pathogen currently causing die-offs of marine mammals: the dolphin morbillivirus (DMV). In particular, from tissues of a positive DMV fin whale (Balaenoptera physalus) stranded along the Italian coastline in October 2013 it was possible to completely sequence the P / V / C gene (1520 bp), M (1007 bp) , N (1573 bp), F (1659 bp) and H (1814 bp) respectively coding for the phosphoprotein and two virulence factors (V and C), for the matrix protein, the nucleoprotein, the fusion protein and the hemagglutinin protein. The complete sequences of the mentioned genes were deposited in GenBank (GenBank provisional Acc. No. KU977449, KU977450, KU977451, KU977452 and KU977453). The isolation of the virus in the tissues was made possible by molecular techniques such as RT-PCR using primers designed ad hoc and cloning using plasmid vector. The nucleotide changes, and consequently the amino acid variations, of each individual gene were subsequently analyzed and compared with the viral genome of the preceding epidemics. It was then possible to carry out a study of the tertiary structure of the viruses to see how these single mutations had a role in the structural change of the proteins themselves. On the basis of this work we proceeded to identify an appropriate diagnostic technique usable even for large whales where correct sampling and appropriate samples storage is not always possible in field condition. We develop a nested RT-PCR which allows the unambiguous identification of a 200 bp fragment of the DMV genome corresponding to a highly conserved part of the gene H. This technique permits, if the viral genome is particularly fragmented because of the poor tissue conservation status, to verify the positivity to the DMV in tissue analysis, to isolate part of the virus, otherwise difficult to be isolated, and it can be sequenced. This technique was later used successfully for identification and sequencing of DMV in the tissues of three sperm stranded in Vasto beach in 2014 (GenBank Acc. No. KU886570). We can therefore say that the DMV is affecting species that until recently were considered species not susceptible to infection, such as fin whale and sperm whale. Individuals of these new species affected by the infection are mainly young animals or even pup and the virus isolation in a fetus organs confirms the possibility of vertical transmission. Given the species barrier carried out by the virus, its point-like changes in the genomic sequence of the virus and incidence of positivity in 19% of the target species in 2015 we can claim to be in a situation where the virus is endemic in the Mediterranean Sea resulting increase in the infectious pressure. Future studies will aim to understand more precisely the role of individual amino acid changes and their influence on the virulence and pathogenicity of the virus through the use of crystallography, to study the structure of the virus cellular receptor, CD150, to understand its real interaction with the virus, and to try to understand the real significance of the DMV in the ecology of the entire cetaceans population in the Mediterranean Sea.

L’immunologia dei mammiferi marini è un campo relativamente recente degli studi scientifici e il suo monitoraggio ha un ruolo importante sulla gestione individuale e di gruppo di questi animali, nonché un crescente valore come indicatore della salute ambientale: i cetacei sono infatti considerati sentinelle ambientali. Le conoscenze attuali relative al sistema immunitario dei cetacei e alla sua funzione sono però incomplete. Questo studio si prefigge dunque lo scopo di implementare le conoscenze sulla risposta immunitaria in condizioni di normalità nei cetacei spiaggiati lungo le coste italiane al fine di fornire una base-line utile per valutare lo stato immunitario di tursiope (Tursiops truncatus) e stenella (Stenella coeruleoalba), specie maggiormente presenti nei nostri mari ed incluse in alcune convenzioni internazionali come specie ad elevata protezione. La selezione degli animali da inserire nello studio si è bastata sulla disponibilità di campioni di milza, timo e tessuto linfonodale dei vari soggetti, sulle modalità (in formalina o congelati) e sullo stato di conservazione degli stessi; sono stati infatti preferiti tessuti di animali il cui campionamento è avvenuto dell’arco delle 48 ore dal decesso al fine di ridurre il più possibile le alterazioni post-mortali. Successivamente gli animali sono stati divisi in gruppi sulla base delle informazioni ottenute dal segnalamento come specie, sesso, classe di età e ambiente di provenienza, sull’esito di indagini virologiche, microbiologiche, parassitologiche e tossicologiche, qualora eseguite, e la causa e/o meccanismo del decesso. Sulle sezioni di linfonodo ottenute dai campioni in formalina è stata effettuata la colorazione di base ematossilina-eosina e le colorazioni immunoistochimiche usando gli anticorpi di seguito elencati: Monoclonal Mouse Anti-Human CD3 per l’identificazione dei linfociti T, Monoclonal Mouse Anti-Human CD20 per l’identificazione dei linfociti B maturi e Monoclonal Mouse Anti-Human HLA-DR Antigen, Alpha-Chain per l’identificazione del complesso maggiore di istocompatibilità di tipo II. Si è inoltre provveduto a validare mediante la tecnica del Western Blotting gli anticorpi che precedentemente sono stati usati in immunoistochimica (IHC). L’uso di questi anticorpi era validato solo per l’uomo ed alcuni animali domestici (cane e gatto), ma non nelle specie di nostro interesse quali tursiope e stenella. Sono stati inoltre testati tramite IHC, con gli anticorpi sopra citati, i tessuti linfoidi di cetacei spiaggiatesi lungo le coste delle isole Canarie usati come controllo negativo in quanto morti verosimilmente a causa di collisioni con barche/navi. Infine è stata effettuata un’analisi semi quantitativa dei campioni mediate l’acquisizione dei vetrini tramite l’acquisitore D-SIGHT e una conta manuale del numero di cellule positive per ogni anticorpo in 10 campi ad ingrandimento 40x ritenuti rappresentativi di tutto l’organo e su questi dati è stata eseguita un’analisi statistica con il metodo del T TEST. L’analisi statistica non ha mostrato alcuna correlazione significativa tra le numerose variabili prese in esame e l’espressione delle diverse popolazioni linfocitarie. Analisi future dovranno essere volte ad analizzare il rapporto tra CD4 e CD8 al fine di capire l’effetto dei principali patogeni immunodepressori, quali il dolphin morbillivirus, sulle sub-popolazioni di linfociti T. Sarebbe inoltre importante comparare i dati ottenuti sul sistema immunitario con quelli ottenuti dagli stessi campioni per quanto riguarda la ricerca di agenti inquinanti ambientali per capirne in reale ruolo sulla salute dei mammiferi marini presenti nei nostri mari. La ricerca non si è però focalizzata solamente sulla risposta immunitaria degli ospiti ai vari patogeni, ma ci siamo concentrati sul patogeno più importante tra quelli che al momento causano morie tra i mammiferi marini: il dolphin morbillivirus (DMV). In particolare, a partire da tessuti di un esemplare DMV positivo di balenottera comune (Balaenoptera physalus) spiaggiatesi lungo le coste italiane nell’ottobre 2013 è stato possibile sequenziare completamente i geni P/V/C (1520 bp), M (1007 bp), N (1573 bp), F (1659 bp) ed H (1814 bp) codificanti rispettivamente per la fosfoproteina e due fattori di virulenza (V e C), per la proteina di matrice, la nucleoproteina, la proteina di fusione e l’emoagglutinina. Le sequenze complete dei geni sopracitati cono state depositate in GenBank (GenBank provisional Acc. No. KU977449, KU977450, KU977451, KU977452 e KU977453). L’isolamento del virus nei tessuti dell’animale è stato possibile grazie a tecniche biomolecolari quali RT-PCR con uso di primers disegnati ad hoc e clonaggio mediante vettore plasmidico. I cambiamenti nucleotidici, e di conseguenza amminoacidici, di ogni singolo gene sono stati successivamente analizzati e confrontati con il genoma virale delle precedenti epidemie. È stato poi possibile eseguire uno studio della struttura terziaria del virus per visualizzare come questi cambiamenti puntiformi avessero un ruolo nel cambiamento strutturale delle proteine stesse. Sulla base di tale lavoro di sequenziamento abbiamo provveduto a individuare una tecnica diagnostica opportuna utilizzabile anche su animali di difficile gestione (difficoltà di campionamento e di conservazione opportuna dei campioni) approntando una nested RT-PCR che permetta l’identificazione univoca di un frammento di genoma di 200 bp corrispondente ad una parte altamente conservata del gene H. Questa tecnica permette, qualora il genoma del virus sia particolarmente frammentato a causa del cattivo stato di conservazione dell’animale, di verificare la positività a DMV del tessuto in analisi, di isolare parte del virus, altrimenti difficilmente isolabile, e di poterlo sequenziare. Tale tecnica è stata poi utilizzata con successo per l’identificazione e il sequenziamento di DMV nei tessuti di 3 capodogli spiaggiatisi a Vasto nel 2014 (GenBank Acc. No. KU886570). È possibile dunque affermare che il DMV sta colpendo specie che fino a poco tempo fa erano considerate specie non sensibili all’infezione, quali balenottera comune e capodoglio. Gli animali di queste nuove specie colpiti dall’infezione sono prevalentemente animali giovani o addirittura cuccioli e l’aver isolato il virus negli organi di un feto conferma la possibilità di trasmissione dello stesso per via verticale. Visto il salto di specie effettuato dal virus, i suoi cambiamenti puntiformi nella sequenza genomica e un’incidenza di positività del virus nelle specie target del 19% nel 2015 possiamo affermare di essere in una situazione in cui il virus è endemico nel Mar Mediterraneo con conseguente aumento della pressione infettante. Gli studi futuri in questo ambito saranno volti a capire in maniera più precisa il ruolo dei singoli cambiamenti aminoacidici e la loro influenza sulla virulenza e patogenicità del virus grazie all’impiego della cristallografia, a studiare la struttura del recettore cellulare del virus, il CD150, per capire la sua reale interazione con il virus, e a cercare di capire la reale rilevanza del DMV nell’ecologia dell’intera popolazione di balenottera comune nel mediterraneo.