Experimental approaches in vitro and in vivo for the pathogenic understanding of Alzheimer's Disease: potential role of metal ions

The etiopathogenesis of Alzheimer’s disease (AD) is far from being clearly understood. However, the involvement of metal ions as a potential key factor to-wards conformational modifications and aggregation of beta-amyloid peptide is widely recognized. The aim of this thesis was to investigate the potential and differ-ential role of metal ions (aluminum, copper, iron and zinc) in affecting the fibril-logenesis of beta-amyloid. Data herein reported demonstrated that the aggregational profile of the beta-amyloid peptide was greatly different according to the metal bound. Particularly, aluminum was the most effective, among the tested metals, in promoting a conforma-tional modification of beta-amyloid which resulted in an increased aggregation rate and ex-pousure of hydrophobic clusters. This modification stabilized the peptide in an oli-gomeric state which is higly toxic to neurons. Furthemore, the peculiar hydrophobic conformation of beta-amyloid-aluminum complex was markedly enhanced in the presence of the beta-amyloid 17-28 fragment with a consequent increase of deleterious effects on cell culture. Moreover, the geno-toxic role of beta-amyloid and beta-amyloid-metal complexes was investigated on neuroblastoma cell culture as a model for the understanding of AD ethiopatho-genesis. In collaboration with the "G. Rossi" hospital (VR), several genetic alterations determined by the beta-amyloid-metal complexes have been correlated with the genetic expression pattern of pheripheral blood samples from AD patients, with the aim of identifying potential diagnostic biomarkers. The most promising data was obtained for the gene which encodes for glutaminyl cyclase. According to the recent literature, this enzyme could be involved in the pathology, even if the mechanism is still elusive, and a significant overexpression of this gene was indeed found in AD patients compared to age-match controls. Additionally, the effect of a 3 month copper-deficient diet on the distribution of several metal ions (aluminum, calcium, copper, iron and zinc) in organs and tissues of adult mice was uncovered. The study highlighted that the copper-deficient diet, besides being effectively in determining copper decrease especially in the frontal area and liver, was also able to determine a decrease in the concentration of the other tested metals, creating a sort of domino effect which detrimentally altered the general metal homeostasis. This aspect has to be taken into account especially when the use of chelating compounds, aiming at restoring the correct metal homeostasis in the brain, is proposed as therapeutic approach for AD.

Il mio lavoro di tesi ha riguardato lo studio dell’implicazione di alcuni metal-loioni come promotori del misfolding del peptide amiloidogenico beta-amiloide, che sembra essere coinvolto nella patogenesi del morbo di Alzheimer (AD). I risultati ottenuti dimostrano come la conformazione del peptide beta-amiloide cambi in funzione del metallo ad esso legato (alluminio, rame, zinco e ferro). In particolare, lo studio ha chiaramente messo in luce come tra i vari ioni metallici testati, l’alluminio sia il catione più efficiente nel promuovere l’aumento sia dell’idrofobicità superficiale che dell’aggregazione del peptide in vitro. Queste modificazioni si riflettono in un notevole aumento della neurotossicità di tale complesso sia rispetto al solo peptide che agli altri complessi metallici. La conformazione ed i diversi effetti biologici sono quindi da attribuirsi unicamente al diverso tipo di aggregato formato in seguito al le-game del peptide con i singoli metalli. Si è inoltre confrontata la propensione a for-mare aggregati dei complessi di beta-amiloide-metalli in presenza ed in assenza del frammento beta-amiloide 17-28. I dati ottenuti indicano una maggiore idrofobicità e capacità di aggregazione del complesso beta-amiloide-alluminio in presenza del frammento beta-amiloide 17-28, caratteristiche che determinano una maggiore tossicità rispetto a tutti gli altri complessi testati. Si è approfondito inoltre il ruolo geno-tossico dei complessi beta-amiloide-ioni metallici su colture cellulari di neuroblastoma umano, come modelli per la comprensione dell’eziopatogenesi molecolare di AD. Le alterazioni genetiche prodotte da tali com-plessi sono state correlate con il pattern di espressione genica di campioni di sangue periferico di pazienti AD selezionati dall’ospedale “G. Rossi” di Verona al fine di identificare test potenzialmente prognostici da sperimentare sulla definizione clinica della patologia. Il dato ottenuto più interessante è relativo alla glutaminil ciclasi, en-zima che potrebbe essere coinvolto nella patologia ed il cui gene è stato visto essere sovraespresso nel sangue periferico di soggetti malati di AD. Complessivamente, i dati sperimentali finora ottenuti fanno quindi supporre un possibile coinvolgimento dell’alluminio, complessato con beta-amiloide, nel processo eziopatogenico dell’AD. È stato infine condotto uno studio sull’effetto della carenza di ra-me su topi adulti che ha messo in evidenza come la rimozione di un metallo essenziale dalla dieta per un periodo di tre mesi determini, a livello cerebrale, una variazione significativa nella concentrazione non solo del rame ma anche di altri metalli essen-ziali quali ferro, zinco e non-fisiologici come l’alluminio. Questo a sottolineare come esista una stretta correlazione tra i diversi sistemi di regolazione nell’omeostasi degli ioni metallici. Tale aspetto è di fondamentale importanza per la progettazione di te-rapie chelanti che mirino a rimuovere depositi anomali di ioni metallici che potrebbero stimolare la patologica aggregazione del peptide beta-amiloide.