HD-ZIP III transcription factors regulate ACL5 and participate with this gene in a regulatory loop controlling vascular development in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

SUMMARY Comprehensive genetic studies in the model plant Arabidopsis thaliana have deduced that the five-member HD-ZIP III gene family regulates, through a complex pattern of overlapping, distinct, and antagonistic roles, meristem initiation, vascular and leaf development, and organ polarity. These developmental processes represent key innovations in land plant evolution, and it has been suggested that HD-ZIP III family genes, which present extensive phylogenetic conservation, were an early component of the land plant developmental tool-kit. The activity of HD-ZIP III family transcription factors is tightly controlled at several different levels by many different mechanisms including miRNA, homo- and hetero-dimerisation, protein-protein interaction and by the action of small molecules such as the hormone auxin and an as yet unidentified lipid ligand. To gain more information on the regulatory circuits in which these transcription factors are involved, one of the major goals is the identification of the target genes directly regulated by HD-ZIP III proteins. A database mining of the Arabidopsis genome searching for genes containing the consensus binding sequence (BS-III) recognised by HD-ZIP III proteins in vitro yielded a list of 390 putative target genes. Among these, the presence of ACAULIS5 (ACL5), encoding a thermospermine synthase, and showing an expression pattern and functional overlap with HD-ZIP III genes seemed particularly meaningful. In vitro binding experiments and expression analysis have given support to the hypothesis that ACL5 could be a genuine primary target gene of HD-ZIP III genes. Thus, the aim of this thesis has been further testing of ACL5 regulation by HD-ZIP III family in vivo and analysis of the functional relationship between these genes in the control of vascular system differentiation in Arabidopsis. In order to confirm in vivo the functional relevance of the HD-ZIP III binding site present in the ACL5 promoter, transgenic Arabidopsis plants expressing the ACL5 coding sequence fused to the sequence encoding the GUS reporter under the control of the ACL5 promoter sequence, either wild-type or mutated in the BS-III element to abolish HD-ZIP III proteins binding, have been generated and characterized. Histochemical analysis of the GUS expression pattern has revealed that the HD-ZIP III family member ATHB8, necessary to define the pre-procambial cells identity, is expressed earlier than ACL5 and that mutations in the BS-III element abolish ACL5 expression in the very early phases of vascular development in leaf primordia, primary root meristem and lateral roots primordia. These results strongly reinforce the hypothesis that ACL5 is a genuine target directly regulated by HD-ZIP III proteins through binding to the BS-III element. To further test in vivo the functional relevance of the BS-III element, ACL5::ACL5:GUS and ACL5mut::ACL5:GUS were introduced also in acl5-1. A careful examination of these transgenic plants clearly demonstrated that BS-III element mutation does not impair complementation of all the phenotypic alterations of acl5-1 plants. Intriguingly, a detailed analysis of leaf veins pattern in these plants have extended our current knowledge of ACL5 role suggesting that xylem differentiation is linked to ACL5 dosage. In fact, although ACL5 has been demonstrated to be necessary to ensure proper vascular differentiation by preventing premature cell death of xylem elements, the data presented here clearly indicate that high ACL5 levels delay or even totally inhibit the differentiation of procambial cells into mature tracheary elements. Additional clues for the functional characterisation of ACL5 were also provided by the observation during this study of previously unnoticed phenotypes of acl5-1 mainly linked to cell proliferation and stress response, such as leaf hyponasty, alteration of root development, anthocyanins accumulation and early flowering. Finally, a careful analysis of the phenotype of double, triple and quadruples mutant combinations of acl5-1 with HD-ZIP III mutants pointed out that, although acl5-1 is epistatic to rev-5 respect to stem elongation, rosette size and fertility, HD-ZIP III proteins also take part to developmental regulatory events downstream of ACL5 as some of the developmental defects of the acl5-1 mutant are compensated for by loss of HD-ZIP III function. In particular, HD-ZIP III genes are required to sustain the formation of extranumerary veins and the ACL5 autoregulatory negative feedback loop in the acl5-1 mutant. As HD-ZIP III genes expression has been reported to be affected by ACL5, a working model is proposed in which progression of procambial cells differentiation is regulated by auxin and HD-ZIP III transcription factor through induction of an enzymatic rheostat, formed by ACL5 and thermospermine, acting back on the expression level of HD-ZIP III genes.

RIASSUNTO I numerosi dati genetici accumulati indicano che i 5 membri della famiglia HD-ZIP III della pianta modello Arabidopsis thaliana sono coinvolti nella regolazione dell’attività dei meristemi, nella formazione della polarità degli organi laterali e dei fasci vascolari, e nel differenziamento del sistema vascolare con una complessa combinazione di funzioni ridondanti, sinergiche e contrastanti. Questi processi di sviluppo rappresentano delle innovazioni fondamentali acquisite durante l’evoluzione delle piante terrestri ed è stato suggerito che i geni della famiglia HD-ZIP III, che presentano una notevole conservazione filogenetica, siano stati tra i primi componenti chiave dei circuiti regolativi che hanno permesso l’evoluzione di un’ampia varietà di specie vegetali adattate alla vita fuori dall’ambiente acquatico. L’attività dei fattori di trascrizione HD-ZIP III è strettamente controllata a diversi livelli attraverso una molteplicità di meccanismi che comprendono la omo- ed etero-dimerizzazione, l’interazione proteina-proteina e la regolazione da parte dei miRNA e di piccole molecole come l’ormone auxina e un ligando lipidico la cui natura non è ancora nota. Per far luce sul meccanismo d’azione dei fattori di trascrizione HD-ZIP III, ci si é proposti di ricercare i geni direttamente regolati da queste proteine. Utilizzando un approccio bioinformatico sono stati identificati nel genoma di Arabidopsis 390 geni contenenti il sito di legame delle proteine HD-Zip III (BS-III). Tra questi, è stata notata la presenza del gene ACAULIS5 (ACL5), codificante per la termospermina sintetasi, che presenta una significativa sovrapposizione funzionale e di espressione con i geni della famiglia HD-ZIP III. Esperimenti di legame in vitro e analisi di espressione hanno fornito una prima conferma sperimentale all’ipotesi che ACL5 sia un autentico gene target della famiglia HD-ZIP III. L’oggetto di questa tesi è stato quindi la verifica in vivo della regolazione di ACL5 da parte della famiglia HD-ZIP III e lo studio della relazione tra questi geni nella regolazione dello sviluppo del sistema vascolare in Arabidopsis. Per verificare in vivo la rilevanza funzionale del sito di legame della famiglia HD-ZIP III nel promotore di ACL5 sono state generate piante transgeniche di Arabidopsis esprimenti la sequenza codificante di ACL5 fusa alla sequenza codificante il reporter GUS sotto il controllo del promotore di ACL5 nella versione selvatica o mutata nell’elemento BS-III in modo da abolire il legame delle proteine HD-ZIP III. L’analisi istochimica del profilo d’espressione del reporter GUS ha mostrato che l’espressione di ACL5 è preceduta da quella di ATHB8, un membro della famiglia HD-ZIP III la cui espressione è necessaria per definire l’identità pre-procambiale delle cellule, e che la mutazione dell’elemento BS-III abolisce l’espressione di ACL5 negli stadi più precoci del differenziamento del procambio nei primordi fogliari, nell’apice radicale e nei primordi delle radici laterali. Questo risultato rafforza l’ipotesi che ACL5 sia un target autentico regolato direttamente dalle proteine HD-ZIP III attraverso il legame all’elemento BS-III. Per verificare ulteriormente il ruolo funzionale dell’elemento BS-III in vivo, i costrutti ACL5::ACL5:GUS e ACL5mut::ACL5:GUS sono stati introdotti anche nel mutante acl5-1. L’analisi fenotipica di queste piante transgeniche ha mostrato che la mutazione del promotore non impedisce la complementazione di tutte le alterazioni fenotipiche del mutante acl5-1. In modo inatteso, l’analisi dettagliata della nervatura delle foglie di queste piante ha permesso di estendere la caratterizzazione funzionale di ACL5 suggerendo che il differenziamento dello xilema è correlato al livello di ACL5. Infatti, sebbene sia stato dimostrato che ACL5 è necessario per permettere il corretto sviluppo vascolare impedendo la morte prematura delle cellule dei vasi, i dati presentati qui indicano chiaramente che alti livelli di ACL5 possono ritardare o inibire completamente il differenziamento delle cellule procambiali in elementi xilematici maturi. Durante questo studio, inoltre, sono stati descritti dei nuovi fenotipi del mutante acl5-1, come l’iponastia delle foglie, l’alterazione dello sviluppo radicale, l’accumulo di antocianine e l’anticipo della fioritura, che hanno permesso di estendere la caratterizzazione funzionale di ACL5 suggerendo un ruolo per questo gene nel controllo della proliferazione cellulare e nelle risposte da stress oltre che nel controllo del differenziamento vascolare. Infine un’attenta caratterizzazione fenotipica di mutanti doppi e multipli ottenuti dall’incrocio di acl5-1 con mutanti dei geni HD-ZIP III ha mostrato che, sebbene acl5-1 sia epistatico su rev-5 rispetto all’allungamento del fusto, alla dimensione della rosetta e alla fertilità, alcune difetti del mutante acl5-1 sono compensati dalla perdita di funzione dei geni HD-ZIP III, indicando che questi partecipano anche ad alcuni degli eventi regolativi a valle dell’azione di ACL5. In particolare, i geni HD-ZIP III sono necessari nel mutante acl5-1 per permettere la formazione di nervature extranumerarie e per sostenere il circuito di regolazione a feedback negativo che regola l’espressione di ACL5. Infine, poiché è noto che ACL5 influenza l’espressione dei geni HD-ZIP III, è stato proposto un modello di regolazione a feedback secondo il quale la progressione del differenziamento delle cellule procambiali é regolata dall’auxina e dai fattori di trascrizione HD-ZIP III attraverso l’induzione di un reostato enzimatico, costituito dalla proteina ACL5 e dal suo prodotto termospermina, che a sua volta modula i livelli di espressione dei geni HD-ZIP III.