Breeding F1 Hybrid Varieties of Leaf Chicory Through Marker-Assisted Selection Schemes

Cichorium (Cichorium intybus subsp. intybus var. foliosum L.) comprises diploid plant species (2n=18) belonging to the Asteraceae family. These species are biennial or, in the wild, perennial species. They are naturally allogamous due to an efficient sporophytic self-incompatibility system. In addition, outcrossing is promoted by a floral morpho-phenology unfavorable to selfing in the absence of pollen donors (i.e., proterandry, wherein the anthers mature before the pistils) and a favorable competition of allo-pollen grains and tubes (i.e., pollen that is genetically diverse from that produced by the seed parents, usually called auto-pollen). Long appreciated as medical plants by the ancient Greeks and Romans, Cichorium spp. are currently among the most important cultivated vegetable crops. They are generally used as components in fresh salads or, more rarely, cooked according to local traditions and alimentary habits. Although this crop does not contribute greatly to the total agricultural income of each country, it is very important at the local level, as it characterizes the agriculture of limited areas, where from 80 to 90% of the country’s production is concentrated. This is indeed the case of Italy, where the Veneto region accounts for 66% of the national acreage and 59% of the national production of the particular type of red or variegated chicory known as “Radicchio”. Radicchio production was for a long time based on farmer’s populations, which are yearly selected and maintained and whose seed is usually reutilized on farm but may also be sold through private and not officially registered transactions. All these populations, obtained by mass selection and maintained through the inter-crossing of selected parents, have to be considered highly heterozygous and genetically heterogeneous whose behaviour and level of adaptation to different environments and/or cultural conditions depend on the frequency of favourable genes or gene combinations. In each breeding program, selection schemes and methods that can be used and the varietal types than can be breed, depend on plant reproductive barriers (e.g. self-incompatibility) and pollination system (e.g. allogamous), and thus on the genetic structure of populations. As a matter of fact, the strong self-incompatibility system found in chicory hinders obtaining highly homozygous parents, made it generally difficult to propose an efficient F1 seed production scheme. Despite the difficulties encountered in obtaining inbred lines by repeated selfing, the recent discovery of spontaneous male-sterile mutants increased the interest towards the production of F1 hybrid varieties. Indeed, male-sterility, or the inability of plants to produce functional pollen, is needful to the commercial production of hybrid seed by crossing parental inbred lines appropriately selected through progeny tests for assessing their specific combining ability. In this project we developed a genotyping method using molecular markers, useful for assessing the homozygosity and genetic stability of single inbred lines and for measuring the specific combining ability between maternal and paternal inbred lines on the basis of their genetic diversity. This information could be exploited for planning crosses and predicting the heterosis of experimental F1 hybrids on the basis of the allelic divergence and genetic distance of the parental lines. Knowing the parental genotypes would enable not only to protect newly registered varieties but also to assess the genetic purity and identity of the seed stocks of commercial F1 hybrids, and to certificate the origin of their food derivatives. Modern marker-assisted breeding (MAB) technology based on traditional methods using molecular markers such as SSRs and SNPs, without relations to genetic modification (GM) techniques, will now be planned and adopted for breeding of vigorous and uniform F1 hybrids combining quality, uniformity, and productivity traits in the same genotypes. Furthermore, this research project deals with the discovery and genetic analysis of four male-sterile mutants in this species. These mutants, which to the best of our knowledge are the first spontaneous male-sterile mutants ever discovered and described in Radicchio, were characterized in great details for the developmental pathway of micro-sporogenesis and gametogenesis, and the inheritance pattern of the gene underlying the male-sterility trait. A quick molecular diagnostic assay was also developed for the early marker-assisted selection of the genotype associated to male-sterile plants. Hence, male-sterile mutants object of this PhD project were demonstrated to be controlled by a single nuclear gene (ms1) that acts at the recessive status. We were able to map the male-sterility gene on a well saturated and characterized linkage group in a chromosomal region spanning 7.3 cM and 5.8 cM from the ms1 locus. On the whole, this information was crucial to plan a Genotyping-by-Sequencing experiment based on BC1 progenies with the aim of narrowing down the genomic window containing the gene for male-sterility in leaf chicory. Finally, the sequencing and assembly of the first genome draft of leaf chicory, will contribute to increase and reinforce the reliability of Italian seed firms and local activities of the Veneto region associated with the cultivation and commercialization of Radicchio plant varieties and food products; the seed market of this species will have the chance to become highly professional and more competitive at the national and international levels. We assembled a genome draft of an estimated size of 760 Mb. We obtained 58,392,530 and 389,385,400 raw reads through the MySeq and HiSeq platforms, respectively. Overall, we identified 66,785 SSR containing regions. Original data from the bioinformatic assembly of the first genome draft of Radicchio, along with the most relevant findings that emerged from an extensive de novo gene prediction and in silico functional annotation of more than 18,000 unigenes are critically discussed. To uncover the sequence of a given genome means to gain a robust scientific background and technological knowhow, which in short time can play a crucial role in addressing and solving issues related to the cultivation and protection of modern Radicchio varieties. In fact, we are confident that our efforts will extend the current knowledge of the genome organization and gene composition of leaf chicories, which is crucial in the development of new tools and diagnostic markers useful for our breeding strategies, and allow researchers for more focused studies on chromosome regions controlling relevant agronomic traits of Radicchio. In conclusion, the present work is a sort of handbook to better understand the world of a non-model species, i.e. leaf chicory, and it is mainly directed to breeders and seed producers dealing with leaf chicory.

Il genere Cichorium (Cichorium intybus subsp. intybus var. foliosum L.) comprende specie vegetali diploidi (2n=18) appartenenti alla famiglia delle Asteraceae. Queste specie sono generalmente biennali o, in natura, perenni. Si tratta di specie prevalentemente allogame a causa di un efficiente sistema di autoincompatibilità sporofitica. Inoltre, la fecondazione incrociata è favorita da una morfologia fiorale sfavorevole all’autofecondazione, se in assenza di un impollinante (ad esempio la proterandria, ovvero la presenza di antere mature prima dei pistilli). In specie di questo genere si riscontra, inoltre, una forte competizione gametofitica, ovvero il rigetto di polline geneticamente simile a quello prodotto dal parentale femminile. A lungo apprezzate come piante medicinali dagli antichi Greci e Romani, le specie del genere Cichorium sono attualmente tra le più importanti specie orticole coltivate. Sono generalmente utilizzate nella preparazione di insalate fresche o, più raramente, cucinate secondo le tradizioni alimentari locali. Anche se la coltivazione della cicoria non contribuisce largamente all’introito agricolo totale di ogni paese, questa risulta essere molto importante a livello locale, in quanto caratterizza l’agricoltura di aree limitate dove è concentrata la coltivazione dell’80-90% della produzione nazionale di questa coltura. Questo è in effetti il caso dell’Italia dove, il 66% dell’ettarato e il 59% della produzione nazionale di una cicoria da foglia rossa o variegata conosciuta come “Radicchio” è concentrata in Veneto. La produzione di Radicchio è stata per un lungo periodo basata su popolazioni mantenute dagli agricoltori, che venivano di anno in anno selezionate e il cui seme veniva solitamente riutilizzato all’interno del centro aziendale o poteva venir venduto attraverso transazioni private e solitamente non ufficiali. Tutte queste popolazioni, ottenute per selezione massale e mantenute attraverso l’interincrocio di parentali selezionati, devono essere considerate altamente eterozigoti e geneticamente eterogenee; il comportamento e il livello di adattamento di queste popolazioni ai diversi ambienti e condizioni agronomiche, è funzione della frequenza di geni favorevoli e della loro combinazione. In ogni programma di miglioramento genetico, gli schemi e i metodi di selezione che possono essere adottati e le tipologie varietali che possono venir costituite, dipendono dalle barriere riproduttive delle piante (come l’autoincompatibilità), dai sistemi di impollinazione (ad esempio l’allogamia) così come dalla struttura genetica delle popolazioni. La forte autoincompatibilità rinvenuta in cicoria, rende estremamente difficile l’ottenimento di parentali altamente omozigoti nell’ottica di un efficiente schema di ottenimento di ibridi F1. Nonostante le difficoltà incontrate nell’ottenimento di linee inbred attraverso cicli ripetuti di autofecondazione, la recente scoperta di mutanti maschiosterili spontanei ha aumentato l’interesse verso la produzione di varietà ibride F1. La maschiosterilità, o l’incapacità delle piante di produrre polline funzionale, è utile per la produzione di seme ibrido commerciale, attraverso l’incrocio di linee inbred parentali appropriatamente selezionate attraverso test di progenie, per stabilire l’attitudine alla combinazione specifica. In questo progetto abbiamo sviluppato un metodo di genotipizzazione utilizzando marcatori molecolari, utile per stabilire il grado di omozigosi e la stabilità genetica di singole linee inbred e per la misurazione dell’attitudine alla combinazione specifica tra linee portaseme ed impollinante sulla base della loro diversità genetica. Queste informazioni possono essere utilizzate per programmare incroci e predire l’eterosi di ibridi F1 sperimentali sulla base della distanza genetica della linee parentali. Conoscendo il genotipo dei parentali, saremo in grado non solo di proteggere ogni nuova varietà rilasciata sul mercato ma anche di stabilire il grado di purezza e identità varietale del seme ibrido commerciale e di certificare l’origine dei suoi derivati alimentari. La costituzione di varietà ibride F1 vigorose e stabili si avvarrà del breeding moderno assistito da marcatori utilizzando tecnologie quali marcatori SSR e SNP, senza alcun collegamento con tecniche di l’ingegneria genetica, combinando tratti di qualità, uniformità e produttività all’interno degli stessi genotipi. Inoltre, nell’ambito di questo progetto di ricerca abbiamo trattato la scoperta e la caratterizzazione genetica di quattro mutanti maschiosterili in questa specie. Questi mutanti, che da quanto ci risulta dalle informazioni in nostro possesso sono i primi mutanti maschiosterili spontanei mai scoperti e descritti in Radicchio, sono stati dettagliatamente caratterizzati per la via metabolica dello sviluppo della microsporogenesi e gametogenesi e per il modello di ereditarietà del gene responsabile della maschiosterilità. Abbiamo sviluppato un saggio diagnostico basato su marcatori molecolari per la selezione precoce di genotipi associati a piante maschiosterili. In questo modo si è dimostrato che i mutanti maschiosterili oggetto di questo progetto di ricerca sono controllati da un singolo gene nucleare (ms1) che agisce allo stato recessivo. Siamo stati in grado di mappare il gene responsabile della maschiosterilità in una regione cromosomica satura e ben caratterizzata di circa 7.3 cM e 5.8 cM dal locus ms1. Complessivamente queste informazioni saranno fondamentali per la pianificazione di un esperimento di Genotyping-by-Sequencing basato su una popolazione BC1 con l’obiettivo di restringere la finestra genomica contenente il gene responsabile della maschiosterilità in cicoria da foglia. Infine il sequenziamento e l’assemblaggio della prima bozza del genoma di cicoria da foglia discussi in questo studio, contribuiranno ad aumentare e rafforzare la credibilità delle ditte sementiere italiane e delle attività locali in Veneto correlate alla coltivazione e la commercializzazione del Radicchio e prodotti alimentari connessi; il mercato sementiero di questa specie avrà la possibilità di diventare altamente professionale e fortemente competitivo a livello nazionale ed internazionale. Abbiamo assemblato una bozza del genoma della misura stimata di 760 Mb. Abbiamo ottenuto 58.392.530 e 389.385.400 sequenze grezze rispettivamente attraverso le piattaforme di sequenziamento MySeq e HiSeq. Abbiamo identificato complessivamente 66.785 regioni contenenti motivi SSR. Abbiamo riportato i dati bioinformatici di assemblaggio della prima bozza del genoma di Radicchio, insieme ai dati più salienti provenienti da una predizione genica de novo e da una annotazione funzionale in silico di più di 18.000 unigenes. La scoperta del genoma di Radicchio significa l’ottenimento di una base scientifica solida e una conoscenza tecnologica tale da giocare in breve tempo un ruolo cruciale nella risoluzione di problematiche legate alla protezione e la coltivazione di moderne varietà di Radicchio. Siamo fiduciosi che i nostri sforzi amplieranno l’attuale conoscenza dell’organizzazione del genoma e della composizione genica della cicoria da foglia, che si ritengono essere fondamentali nello sviluppo di nuovi strumenti e saggi diagnostici basati su marcatori molecolari utili alle strategie di costituzione varietale e che permettano studi più specifici di tratti cromosomici che controllino aspetti agronomici rilevanti in questa specie. In conclusione, il presente lavoro è da leggersi come una sorta di manuale per meglio capire il mondo di una specie non modello come la cicoria da foglia, orientato prevalentemente verso i costitutori genetici e i produttori di sementi di cicoria.