Characterization of Isoprene Synthase from Arundo donax L. in Relation to Abiotic Stress Tolerance

Isoprene (2-methyl-1,3-butadiene, C5H8) is a five carbon volatile hydrocarbon compound, which is synthesized through methylerythritol phosphate (MEP) pathway in the chloroplasts of many plant species. Isoprene has been suggested to enhance plants tolerance to stressful conditions because its emission could be stimulated when leaves are subjected to or recovering from environmental stresses. Physiological function(s) of isoprene emission has been studied for a long time, and previous studies well documented that isoprene emission can enhance plant thermotolerance and oxidative stress resistance; however, whether isoprene emission may increase plant tolerance to drought stress is less studied, and the molecular mechanisms of isoprene emitting plants in response to drought-related stress have never been investigated before. In this study, we characterized the physiological function of the first IspS gene (AdoIspS) from a monocot species, Arundo donax L., in response to different abiotic stresses. First of all, Phenotypic differences under normal growth condition between AdoIspS transgenic and Col-0 wild type plants were observed as follows: earlier flowering time, tendency to higher leaf biomass even though no significant difference, and a higher seed production derived from higher numbers of branching in AdoIspS transgenic plants. The results suggested that isoprene emission may provide a selective advantage to plants by enhancing plant growth rate. In order to investigate the protective function of isoprene emission in response to abiotic stresses, first, the enhanced thermotolerance was tested by analyzing the survival ability between AdoIspS transgenic plants and Col-0. The results indicate that after recovering from the heat shock, AdoIspS transgenic plants exhibited a higher survival rate, chlorophyll content and fresh weight at different developmental stages, which revealed that the transformation of AdoIspS gene isolated from a monocot species can provide similar thermotolerance to isoprene non-emitter as IspSs from dicots. Second, we investigated AdoIspS transgenic plants sensitivity to exogenous abscisic acid (ABA). AdoIspS transgenic plants showed a decreased sensitivity to exogenous ABA application at both germination and seedling stages. qPCR results indicate that under the treatment of ABA on root part, the regulation of ABA-induced genes and ABA biosynthesis genes in root is not affected by the presence of AdoIspS; however, in AdoIspS transgenic leaves, ABA-response mark genes are up-regulated and ABA biosynthesis genes are down-regulated, which supports the idea that isoprene emission may reduce ABA biosynthesis and accumulation in leaves. Therefore, the growth inhibition from exogenous ABA treatment decreased in AdoIspS transgenic plants. To elucidate whether and how the dehydration tolerance was altered or not in later developmental stage of AdoIspS transgenic plants, AdoIspS transgenic Arabidopsis lines were further applied in dehydration stress studies. The results of water loss test and stomatal aperture assay consistently demonstrated that isoprene-emitting plants may have a reduced requirement for ABA to tolerant dehydration stress. Additionally, the survival rate, lipid peroxidation test and dehydration-related gene expression were measured to analyze AdoIspS transgenic plant tolerance to dehydration stress at the whole-plant level, and the results indicate that the better dehydration tolerance displayed in AdoIspS transgenic lines maybe due to the reduced ROS accumulation in isoprene-emitting leaves. These findings suggested that AdoIspS gene plays an important role in plant's tolerance to abiotic stress conditions. Understanding the regulatory mechanisms of AdoIspS gene in response to abiotic stresses could help us find out why isoprene-emitting plants cope better with transient stress events in nature.

Isoprene (2-methyl-1,3-butadiene, C5H8) è un idrocarburo volatile con cinque atomi di carbonio, sintetizzato dalla via metabolica del MEP (metileritritolo fosfato) nei cloroplasti di varie specie di piante. È stato suggerito che l’isoprene possa aumentare la tolleranza delle piante alle condizioni di stress, perché la sua emissione potrebbe essere stimolata quando le foglie sono sottoposte a stress ambientali o ricuperano da essi. Le funzioni fisiologiche dell’emissione di isoprene sono state studiate per lungo tempo. Le ricerche precedenti hanno ben documentano che l’emissione di isoprene può aumentare la tolleranza termica o la resistenza allo stress ossidativo delle piante, ma è meno chiaro se l’emissione di isoprene può aumentare la tolleranza allo stress idrico, e i meccanismi molecolari delle piante che emettono isoprene in relazione alla siccità non sono mai stati investigati prima. Nel presente lavoro, abbiamo caratterizzato la funzione fisiologica del primo gene IspS (AdoIspS) di una specie di monocotiledone, Arundo donax L., in relazione a differenti stress abiotici, tramite overespressione in Arabidopsis thaliana. Le piante transgeniche hanno mostrato una maggiore produzione di semi rispetto a quelle non trasformate. Dopo aver confrontato il tempo di fioritura, la biomassa fogliare e la morfologia delle piante tra tipo selvatico (WT) Col-0 e linee IspS, i risultati suggeriscono che l’emissione di isoprene potrebbe fornire un vantaggio selettivo alle piante attraverso l’aumento del tasso di crescita delle piante. Per investigare la funzione protettiva dell’emissione di isoprene in relazione a stress abiotici, in primo luogo, è stata esaminata la tolleranza termica tramite l’analisi comparativa dell’abilità di sopravvivenza tra piante IspS e Col-0. I risultati indicano che, dopo aver recuperato dallo shock termico, le piante IspS hanno mostrato un più elevato tasso di sopravvivenza, contenuto di clorofilla e peso fresco in diverse fasi di sviluppo. Questo ha rivelato che la trasformazione del gene IspS, isolato da una specie di monocotiledoni, può conferire tolleranza termica a una specie che non emette isoprene, analogamente alle IspSs da dicotiledoni. In secondo luogo, abbiamo investigato la sensibilità delle piante IspS alla somministrazione di acido abscissico esogeno (ABA), in quanto l’ABA è una molecola-chiave nella protezione delle piante sotto stress idrico, ed è prodotto a valle della via biosintetica del MEP. Le piante IspS hanno mostrato una ridotta sensibilità all’applicazione esogena di ABA sia in fase di germinazione sia in fase di semina. I risultati di qPCR indicano che, con il trattamento di ABA alla parte ipogea della pianta, la regolazione dei geni indotti da ABA e dei geni di biosintesi dell’ABA in radice non è influenzata dalla presenza di IspS. Tuttavia, nelle foglie transgeniche per IspS, l’espressione dei geni reattivi all’ABA viene indotta, mentre quella dei geni di biosintesi dell’ABA è repressa. Questi risultati supportano l’idea che l’emissione di isoprene potrebbe essere implicata nella biosintesi e accumulo fogliare di ABA. Pertanto, la presenza di IspS potrebbe influire/alterare ulteriormente il meccanismo della tolleranza alla siccità delle piante che non emettono isoprene, mediando i meccanismi dipendenti dall'ABA di protezione contro lo stress idrico. Per verificare se ed in caso come la trasformazione di IspS altera la tolleranza alla disidratazione delle piante, nell’ultima parte del lavoro, le linee di Arabidopsis transgeniche per IspS sono state utilizzate nello studio di stress conseguente alla disidratazione. I risultati del test di perdita di acqua e l’analisi dell’apertura stomatica confermano che, le piante che emettono isoprene potrebbero richiedere una quantità minore di ABA per tollerare lo stress causato da disidratazione. Inoltre, il tasso di sopravvivenza, come anche il test di perossidazione dei lipidi e l’espressione dei geni relativi alla disidratazione sono stati misurati per analizzare l’aumentata tolleranza alla disidratazione delle linee IspS a livello di intera pianta. I risultati indicano che la migliore tolleranza alla disidratazione mostrata in piante transgeniche per IspS forse risulta dal ridotto accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS) in foglie che mettono isoprene. Queste scoperte suggeriscono che il gene IspS ha un ruolo importante nella tolleranza delle piante a condizioni di stress abiotico. Comprendere i meccanismi regolatori del gene IspS in risposta allo stress abiotico potrebbe aiutarci a scoprire perché le piante che emettono isoprene superano meglio gli eventi di stress transitorio in natura.