Implicazioni biologiche di SerpinB3 nella fibrosi epatica e nell'epatocarcinoma

BACKGROUND SERPINB3 is a serine protease inhibitor belonging to the serpin family, characterized by pleyotropic functions. TGF-beta1 is the master cytokine in the pathogenesis of liver fibrosis. Inflammatory and mesenchymal cells, including hepatic stellate cells, have been identified as the principal source of this cytokine, however growing evidence also supports the ability of parenchymal hepatocytes to produce TGF-beta1. Recently, a direct correlation between TGF-beta1 and the ov-serpin SERPINB3 has been reported in idiopatic pulmonary fibrosis, whose pathological features recall cirrhosis pathogenesis. SERPINB3, a serine protease inhibitor up-regulated in cirrhosis, dysplastic nodules and hepatocellular carcinoma (HCC), can trigger epithelial to mesenchymal transition (EMT) in HepG2 cells. EMT is also triggered by hypoxia which is common in HCC and believed to favour selection of more invasive tumour cells and cancer progression. AIM Aim of the first study was to assess the potential correlation between SERPINB3 and TGF-beta1 in chronic liver diseases and to determine their relationship using in vitro models of cells transfected with SERPINB3. Aim of the second study was to investigated molecular mechanisms involved in SERPINB3-mediated EMT induction and the relationship between hypoxia and SERPINB3 expression in vitro, by employing normal and SERPINB3-transgenic HepG2 cells or in vivo by immunohistochemistry (IHC) on specimens from cirrhotic patients carrying HCC. METHODS In the first study SERPINB3 and TGF-beta1 expression in liver biopsies from 80 patients with chronic liver disease (59 chronic hepatitis and 21 liver cirrhosis) was evaluated by immunohistochemistry and by Real time PCR. To investigate whether SERPINB3 could affect TGF-beta1 expression, TGF-beta1 was determined in HepG2 cells transfected with SERPINB3 and in control HepG2 cells at transcription and protein level by Real time PCR and ELISA assay. In the second study SERPINB3 up-regulation, involvement of hypoxia inducible factors (HIFs) and signal transduction pathways, intracellular generation of reactive oxygen species (ROS), EMT and invasiveness were analysed by morphological, molecular and cell biology techniques in HepG2 cells, exposed to hypoxia and/or incubated with wild type and mutated SERPINB3 recombinant proteins. Moreover, liver specimens from either HCV cirrhotic patients carrying HCC or from transgenic mice over-expressing SerpinB3 were analyzed by immunohistochemistry. RESULTS Study I In chronic hepatitis and liver cirrhosis a strong positive correlation was observed between SERPINB3 and TGF-beta1 immunoreactivity. At transcription level, cDNA amplification profiles of SERPINB3 and TGFbeta1 were similar in the majority of the cases. A significant correlation was found between the degree of parenchymal TGF-beta1 1 and SERPINB3 expression and the severity of liver fibrosis. Neither of the two molecules were detectable in 20 normal livers. Time course analysis of TGF-beta1 1 over time in SERPINB3 transfected cells showed an increase of this cytokine, with a peak value at 48 hours for TGF-beta1 1 mRNA and at 72 h for protein production. Study II EMT and increased invasiveness triggered by wild-type and mutated recombinant SERPINB3 are independent of their anti-protease activity and involve intracellular generation of ROS and redox-dependent, phosphorylation of GSK3beta. SERPINB3 transcription, protein synthesis and release in the medium are up-regulated under hypoxia, almost abolished by specific silencing of HIF-2alpha (but not HIF-1alpha), significantly modulated by hypoxia-dependent intracellular generation of ROS and involve Ras/Erk and PI3K signalling pathways. In addition, liver specimens revealed co-localization of HIF-2alpha and SERPINB3 immunostaining in either HCC cells and in hepatocytes of surrounding cirrhotic liver. CONCLUSIONS Study I SERPINB3 is overexpressed in chronically damaged hepatocytes, where increased TGF-beta1 has also been documented. The positive correlation found between the expression of either TGF-beta1 and SERPINB3 and fibrosis grade supports the dynamic interplay of these molecules, suggesting that SERPINB3 could orchestrate the most peculiar aspects of chronic liver disease by inducing TGF-beta1 production, leading to enhanced collagen synthesis and by increasing the survival capacity of damaged hepatocytes. Study II Hypoxia, through a common redox sensitive signalling, can switch on both EMT program and SERPINB3 expression. Hypoxia may then sustain increased invasiveness in cancer cells by a release of HIF2-dependent SERPINB3 molecule. This serpin could elicit EMT and invasiveness even in normoxic surrounding cells, then enhancing its putative role in carcinogenesis.

INTRODUZIONE SERPINB3 appartiene alla famiglia delle serpine, inibitori delle proteasi seriniche implicati in molte funzioni biologiche e nei processi di controllo dell'omeostasi cellulare. E' espressa normalmente negli epiteli squamosi, ma si trova iper-espressa nelle cellule neoplastiche di origine epiteliale e nell'epatocarcinoma ma anche in noduli cirrotici ad alto grado di displasia. TGF-beta1 una citochina multifunzionale, coinvolta nella regolazione della proliferazione, differenziamento e migrazione di molti tipi cellulari ed il più importante fattore implicato nel processo di fibrogenesi epatica, dove regola la sintesi di collagene nelle cellule stellate epatiche. Recentemente in un'altra patologia fibrosante progressiva, quale la fibrosi polmonare idiopatica, è stata documentata una correlazione diretta tra entità di espressione di TGF-beta1 e della serpina SERPINB3, con co-localizzazione delle due molecole a livello cellulare. Recenti studi sperimentali condotti nel nostro laboratorio suggeriscono il coinvolgimento in vitro di SERPINB3 in caratteristiche tipiche della transizione epitelio mesenchimale, (EMT) un fenomeno chiave anche nell'epatocarcinoma. Inoltre, ulteriori risultati descritti in letteratura identificano l'ipossia, una delle condizioni più comuni che si instaurano nel microambiente tumorale, come condizione in grado di indurre in modo indipendente EMT e lo stesso fenomeno di transizione epitelio mesechimale è indotto anche dalla citochina TGF-beta1 . SCOPO Studio I Lo scopo della prima parte della tesi è valutare la potenziale correlazione tra SERPINB3 e TGF-beta1 nel fegato in pazienti con danno epatico cronico e valutare la relazione tra queste due molecole utilizzando modelli in vitro di colture cellulari trasfettate con SERPINB3. Studio II Lo scopo della seconda parte della tesi è quello di caratterizzare gli stimoli regolatori e i meccanismi dell'induzione di SERPINB3 come fattore solubile in grado di indurre l'invasività e la transizione epitelio mesenchimale. Inoltre, ulteriore scopo è valutare la correlazione tra ipossia e SERPINB3 ed i relativi meccanismi di regolazione sia in modelli in vitro che in vivo. MATERIALI E METODI Per quanto concerne il primo studio sono stati studiati 80 pazienti, di cui 59 con epatite cronica e 21 con cirrosi epatica. L'espressione di SERPINB3 e TGF-beta1 stata analizzata su biopsie epatiche di pazienti con epatite cronica a livello proteico mediante immunoistochimica e a livello trascrizionale mediante PCR quantitativa. Il modello in vitro prevedeva la trasfezione transiente e stabile di cellule HepG2 con il gene SERPINB3 wild type e con differenti vettori caratterizzati da estensioni diverse di delezione del sito attivo della serpina, responsabile della sua attività  antiproteasica, con successiva analisi dell'espressione genica e proteica. Per quanto riguarda il secondo studio sono stati effettuate analisi di immunofluorescenza e invasività  in cellule HepG2 trattate con diverse forme di proteina SERPINB3 ricombinante per valutarne l'effetto di trasformazione epitelio-mesenchimale e la generazione intracellulare di specie reattive all'ossigeno (ROS). Inoltre le cellule sono state mantenute in condizioni di ipossia (3%O2 ) per studiare il comportamento di SERPINB3 ed è stato effettuato il silenziamento genico per i fattori inducibili in ipossia (HIF) al fine di determinare il loro coinvolgimento. L'espressione di SERPINB3 e dei fattori relativi all'EMT e all'ipossia sono stati valutati anche su biopsie epatiche in pazienti con epatocarcinoma. RISULTATI Studio I L'analisi immunoistochimica nel fegato ha documentato una significativa correlazione positiva con co-localizzazione di SERPINB3 e TGF-beta1 nelle cellule parenchimali del fegato. Anche a livello trascrizionale l'espressione di mRNA ha confermato un simile andamento, con livelli di espressione genica sostanzialmente sovrapponibili (r=0,7483, p=0,0070). Inoltre, l'espressione di entrambe le molecole è risultata e positivamente correlata con l'entità  della fibrosi. In cellule HepG2 trasfettate con il gene SERPINB3 è stata documentata un'induzione di TGF-beta1 sia dal punto di vista trascrizionale che della produzione proteica. I risultati ottenuti dalla trasfezione hanno dimostrato che è cruciale l'integrità  del sito attivo della serpina per l'induzione di TGF-beta1 , in quanto questa citochina è totalmente assente nei vettori con la delezione del sito antiproteasico di SERPINB3, mentre dove la delezione è minore, si riscontra una ridotta induzione, rispetto al controllo. Studio II SERPINB3 induce EMT e aumenta l'invasività  in cellule HepG2 mediante il coinvolgimento di ROS e la fosforilazione di GSK3b, indipendentemente dall'attività antiproteasica della serpina. In condizioni di ipossia si osserva un aumento della trascrizione e sintesi di SERPINB3, modulata dalle vie di segnale Ras/ERK e PI3K e completamente dipendente dal gene HIF-2alpha. Questi dati sono stati confermati nel topo transgenico per SERPINB3, dove è stata dimostrata un'iperespressione della molecola nelle zone ipossiche circostanti le vene centro globulari. Inoltre, in biopsie di pazienti con epatocarcinoma è stata confermata una colocalizzazione di SERPINB3 e HIF-2alpha CONCLUSIONI Studio I Nella malattia epatica cronica evolutiva esiste una correlazione diretta tra espressione di SERPINB3 e TGF-beta1. La correlazione di entrambe queste molecole con il grado di fibrosi epatica rafforza l'ipotesi di una loro potenziale interazione nel processo fibrogenetico epatico. In modelli in vitro SERPINB3 è in grado di indurre l'espressione di TGF-β e questo effetto dipende dalla sua attività  antiproteasica. Alla luce di queste considerazioni SERPINB3 potrebbe essere considerato un bersaglio terapeutico per contrastare il processo di fibrogenesi. Studio II L'ipossia può indurre SERPINB3 e conseguente trasformazione epitelio-mesenchimale mediante la produzione di radicali liberi dell'ossigeno. L'ipossia inoltre è il primo stimolo di rilevanza fisiopatologica descritto in letteratura capace di modulare la trascrizione e l'espressione di SERPINB3 attraverso un meccanismo dipendente dal gene HIF-2alpha.