Modificazione della flora intestinale e obesità : possibile ruolo di resistin-like Molecule Beta (RELM Beta)

Obesity is due to complex interactions between genetic background and environmental factors, such as diet and lifestyle. Experimental studies suggest that gut microbiota of obese subjects differs from lean ones and that changes in gut microbiota (prevalence of phylum Firmicutes in obese condition) are associated to body weight gain and fat accumulation. Conventional mice have significantly more body fat than germ-free counterparts, and germ-free mice are protected from diet-induced obesity. New evidences in literature show the important role of Resistine-like molecule β ( Relmβ ) played in microbiota composition and in induction of insuline resistence. Moreover the intestinal bacterial omeostasis is regulated from antimicrobical peptides secreted from Paneth cells. In the gut of α Defensin5 KO mice there is a predominant presence of bacteria from phylum Firmicutes. In order to investigate the relationship among intestinal microbiota changes, innate immunity and pathogenesis of obesity, male C57Bl/6 WT and Tlr2-/- mice were randomly allocated to receive either regular chow food (RCF) or a very high fat diet (VHFD) for 10 weeks (wks). Body weight was recorded weekly, oral glucose tolerance test, steatosis, liver inflammation, antimicrobical peptides and Relmβ expression were assessed in ileum of animals sacrificed following 2, 4, 6 and 10 weeks of diet. In addition, faecal samples were collected every two weeks and the faecal flora studied by PCRDGGE with universal primers. In order to investigate the potential effects of probiotics in balancing of gut microbiota and improve metabolic syndrome, male C57Bl/6 mice 4 weeks old were fed VHFD and daily supplemented with 108 cfu of Lactobacillus crispatus M247 for 10 weeks. Gut microbiota of diet-induced obese mice resulted in an increased presence of phylum Firmicutes compared to mice fed a normocaloric diet. These changes in Gram positive microbiota composition were showed after 4 weeks on VHFD and these modifications were stably maintained over the period of VHFD administration. WT and TLR2-/- mice on RCF showed comparable body weight gain whereas TLR2-/- mice on VHFD were more prone to body weight gain than WT mice (32.05±0.5 g and 27.5±0.49 g, respectively, at 10 wks, p<0.02). In WT mice on VHFD Relm β mRNA level (p=0,02 vs mice on RCF) is increased whilst expression of intestinal antimicrobical peptides (RegIIIβ, RegIIIγ) mRNAs is downregulated ( p=0,01vs mise on RCF ). Indeed, hRELMβ caused a significant upregulation of βDefensins and αDefensins ( p=0,03 and p=0,02 respectively ) in an vitro model of intestinal epithelial cells ( CaCo2 ). Interestingly, we observed limited changes of gut microbiota in mice receiving a VHF and oral supplementation with L. crispatus M247 (e.g. the presence of Firmitutes is not predominant like mice on VHFD without supplementation of probiotic strain). Indeed, mRNA level of Relm β in ileum was down-regulated (p=0,01 vs mice on VHFD) whilst the expression of intestinal antimicrobical peptides was up-regulated ( p=0,05 vs mise on VHFD). Strikingly, L. crispatus M247 significantly inhibited stearic acid induced Relm β up-regulation in Caco2 cells in vitro. This data is extremely interesting since L. crispatus M247 supplementation significantly improved glucose tolerance test (AUC: 591±94 mg/dl2 in VHFD mice vs 397±37 mg/dl2 in VHFD mice plus L. crispatus M247, p<0.02) although mice receiving probiotic supplementation did not show significant differences in body weight gain as compared to mice receiving only VHFD. In summary we suggest that microbiota modifications preceed the development of a diet induced obese phenotype and these changes can be triggered by changes in the mucosal production of RELMβ, a key factor involved in glucose and gut microbiota homeostasis. Probiotic supplementation, affecting RELMβ production might favorably affect gut microbiota and metabolic syndrome severity

L’obesità è dovuta alla complessa interazione tra componenti genetiche e fattori ambientali, come la dieta e lo stile di vita. Studi sperimentali condotti in vivo dimostrano come la composizione della flora intestinale dei soggetti obesi differisca dai soggetti non obesi e come questi cambiamenti siano associati all’aumento di peso. I topi germ-free presentano meno accumulo di grasso rispetto ai topi normali e sono meno predisposti all’obesità non genetica ( obesità indotta dalla dieta ). Studi recenti hanno messo in evidenza l’importanza del ruolo svolto dalla Resistin-like Molecul β ( Relm β ) nella composizione della flora intestinale e sull’insulino-resistenza. L’omeostasi batterica, tuttavia, viene regolata dalla produzione a livello intestinale da peptidi antimicrobici secreti dalla cellule del Paneth: le defensine. In topi mancanti del gene che codifica per la αDefensina 6, infatti, si verifica la prevalenza del phylum batterico dei Firmicutes. Allo scopo di chiarire la relazione tra la modificazione della flora intestinale, immunità innata e obesità, topi C57Bl/6 WT e Tlr2-/- (deficienti del gene che codifica per il recettore TLR2 dell’immunità innata) sono stati posti per 10 settimane a dieta normocalorica e iperlipidica (VHF Very High Fat diet). Il peso corporeo è stato registrato settimanalmente, mentre il test di tolleranza al glucosio, la steatosi, l’infiammazione, la valutazione dell’espressione di Relmβ e dei peptidi antimicrobici nell’ileo degli animali trattati, sono state effettuate a 2, 4, 6, 10 settimane. Contemporaneamente campioni fecali sono stati raccolti ogni due settimane e lo studio sulla composizione della flora batterica è stato condotto tramite PCR-DGGE con primer universali amplificanti la regione 16S ribosomiale batterica. Allo scopo di investigare l’effetto di un microrganismo probiotico sulla composizione della flora intestinale e sulla sindrome metabolica, topi C57Bl/6 di 4 settimane di vita sono stati alimentati con dieta normocalorica e VHF supplementata e non con Lactobacillus crispatus M247 per 10 settimane. I topi WT C57Bl/6 tenuti a dieta VHF presentano una flora intestinale costituita prevalentemente da Firmicutes rispetto ai topi WT tenuti a dieta normocalorica. Questi cambiamenti sono stati osservati dopo 4 settimane di dieta grassa e queste modificazioni sono persistite per la restante parte del periodo di somministrazione della dieta. I topi WT e TLR2-/- tenuti a dieta normocalorica hanno avuto un incremento di peso paragonabile, mentre nel gruppo VHF i i topi TLR2-/-hanno raggiunto un peso maggiore rispetto ai topi WT ( 32.05±0.5 g and 27.5±0.49 g, a dieci settimane rispettivamente p<0.02). Nei topi WT a dieta VHF i livelli di mRNA di Relm β nell’ileo risultano aumentati rispetto ai topi tenuti a dieta normocalorica (p=0,02 vs topi a dieta normocalorica ), mentre l’espressione dei peptidi antimicrobici risulta diminuita (p=0,01vs topi a dieta normocalorica ). Inoltre, hRELMβ causa una significativa down-regulation di βDefensine ed αDefensina (p=0,03 and p=0,02 rispettivamente) in un modello in vitro di cellule epiteliali intestinali ( CaCo2 ). Sorprendentemente è stato osservato un limitato cambiamento nella composizione del microbiota in topi che hanno ricevuto una dieta VHF supplementata con Lactobacillus crispatus M247. ( la presenza di Firmicutes non è così predominante come nei topi a dieta VHF senza supplementazione con il probiotico ). Inoltre i livelli di mRNA di Relm β nell’ileo risulta down-regolata (p=0,01 vs topi VHF), mentre l’espressione di peptidi antimicrobici risulta up-regolata (p=0,05 vs topi VHF). Inoltre, L. crispatus M247 inibisce l’up-regolazione indotta da Acido Stearico di Relm β nelle cellule Caco2 in vitro. Questi dati sembrano molto interessanti se si pensa che la supplementazione di L. crispatus M247 migliora la tolleranza al glucosio (AUC: 591±94 mg/dl2 in topi VHF vs 397±37 mg/dl2 in topi VHF+L. crispatus M247, p<0.02), sebbene i topi che hanno ricevuto la supplementazione non mostrano differenza significative nell’aumento di peso rispetto ai topi tenuti a dieta VHF senza supplementazione. Riassumento si può concludere che: le modificazioni della flora intestinale precede l’aumento di peso nel modello di obesità non genetica utilizzato e che, questi cambiamenti potrebbero essere legati ai cambiamenti di produzione mucosale di RELMβ, fattore chiave nell’omeostasi del glucosio e del microbiota intestinale. Inoltre la supplementazione dietetica, attraverso una down-regolazione dell’espressione di RELMβ favorisce l’attenuarsi della severità della sindrome metabolica