Ruolo della regolazione post-traduzionale del fattore di trascrizione FoxO3 nel muscolo scheletrico durante l'atrofia muscolare

FoxO proteins are transcription factors that control cell cycle progression, DNA repair, muscle atrophy, stress resistance and apoptosis. These divergent functions are carefully regulated by post-translational modifications including phosphorylation, acetylation and ubiquitination, these mechanisms seem to coordinate the localization, activity and longevity of FoxO protein in a time-dependent manner to ensure a fine regulation. During muscle atrophy FoxO3 is negatively regulated by AKT phosphorylation, which determines its nuclear localization and activation. We studied the role of acetylation on FoxO3 in adult skeletal muscle, a post translational modification that modulates FoxO activity. To fulfill this purpose, we have generated different FoxO3 mutants which prevent acetylation (KR) or mimic acetylation (KQ). By a Luciferase assay, we discovered that mutants show the opposite behavior in activating the promoter, notably acetylation-mimicking mutants displayed a lower transcriptional activity. Moreover hyperacetylation reduces FoxO-dependent muscle atrophy by causing re-localization of FoxO proteins into the cytoplasm. Finally we found out that along with the quantity of the acetylated residues their position is important as well. In particular K262 seems to be a key residue for the nuclear export. In conclusion, we can assert that our findings shed light on the complex regulation of FoxO transcription factors, explaining how acetylation negatively modulates FoxO activity.

La perdita di massa muscolare è una condizione debilitante che aggrava il quadro clinico di diverse patologie sistemiche e per la quale al momento non esiste alcuna terapia efficace che ne blocchi l’insorgenza dei sintomi. L’identificazione della famiglia dei fattori di trascrizione FoxO come responsabile dell’espressione delle ubiquitina-ligasi, Atrogin-1 e MuRF1, e della perdita di massa muscolare potrebbe far supporre di aver trovato un buon bersaglio per lo sviluppo di farmaci atti a bloccare la perdita di massa del muscolo scheletrico agendo proprio su FoxO, inibendone l'attività. Tuttavia questa idea potrebbe portare ad alcuni problemi, infatti lo sviluppo di un inibitore di FoxO potrebbe, da una parte, frenare la perdita di proteine muscolari, ma dall’altra potrebbe favorire l’insorgenza di tumori, di malattie autoimmuni e di altre patologie. Questo dualismo è dovuto al controllo che FoxO3 ha su molti aspetti della biologia cellulare come l’apoptosi, il ciclo cellulare, la gluconeogenesi, la sensibilità all’insulina e controlla questi processi biologici in maniera sia cellulo-specifica che tessuto-specifica. Il nostro approccio, per essere efficace, dovrebbe quindi essere basato sull’inibizione specifica dell’interazione di FoxO3 con i promotori dei geni dell’atrofia nel muscolo scheletrico. Tuttavia questo modello implica una conoscenza dettagliata della regolazione di FoxO3 all’interno del nucleo della fibra muscolare e della sua interazione con i promotori dei geni dell’atrofia. Per raggiungere questo scopo ci siamo addentrati nello studio dei meccanismi di modificazione post-traduzionale che modulano negativamente l’attività del fattore trascrizionale FoxO3: fosforilazione, acetilazione e ubiquitinazione. Quando è accesa la via di segnale PI3K/AKT, FoxO3 è normalmente fosforilato e inattivo, venendo trattenuto nel citoplasma. Quando, durante l'atrofia, questa via è repressa, FoxO3 può traslocare nel nucleo dove attiva la trascrizione dei geni bersaglio (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). La prima parte del mio dottorato si è incentrata sullo studio di un meccanismo in grado di regolare negativamente l'attività di FoxO3 quando questo si trova all'interno del nucleo, dove è normalmente attivo: l'acetilazione. Dati in letteratura hanno dimostrato mediante analisi di spettrometria di massa che in seguito a stress ossidativo si ha acetilazione di particolari lisine di FoxO3, condizione presente durante le atrofie (Brunet 2004, Greer and Brunet 2005). Per capire il ruolo dell’acetilazione abbiamo deciso di mutare le lisine acetilabili in arginine, residui non acetilabili che mantengono la carica positiva permettendo il legame al DNA, o in glutamine, residui privi di carica che permettono di mimare un’acetilazione costitutiva. Abbiamo testato l'attività trascrizionale dei vari mutanti mediante saggi di luciferasi, utilizzando come "reporter" un costrutto in cui il gene delle luciferasi è fuso ad un promotore composto da sei ripetizioni seriali della sequenza nucleotidica riconosciuta da FoxO. I risultati ottenuti con i mutanti hanno confermato che l’acetilazione modula la capacità di FoxO3 di legarsi ad un promotore. La diminuzione dei residui acetilabili induce un aumento dell’attività trascrizionale in maniera pressoché lineare, si è infatti osservato un aumento dell’attività trascrizionale di una volta e mezza quando si mutavano tre siti ed un incremento di tre volte quando si mutavano sei lisine. In contrapposizione i mutanti che mimavano l’acetilazione causavano una netta diminuzione delle capacità trascrizionali di FoxO3. Il dato conferma che la regione che regola il legame al DNA e l’import nucleare è sensibile a cambiamenti della carica elettrostatica causata dall’acetilazione. Tuttavia questi dati sulle capacità trascrizionali di FoxO3 e dei mutanti di coordinare un programma complesso come quello dell’atrofia muscolare sono stati solo parzialmente confermati dagli esperimenti in vivo. Infatti, mentre i mutanti che mimano l’acetilazione hanno causato una riduzione dell’attività atrofizzante di FoxO, i costrutti che bloccavano l’acetilazione non hanno esacerbato l’atrofia indotta da FoxO. Una possibile spiegazione per cui il blocco dell’acetilazione non causa una maggiore perdita di proteine sta nel fatto che la cinetica di degradazione delle proteine è, probabilmente, già al massimo delle sue potenzialità. FoxO3 è capace di indurre una elevata espressione delle ubiquitina-ligasi E3 Atrogin-1 e MuRF-1, la cui attività è regolata dalla presenza di molecole quali l’ubiquitina, i substrati e l’ATP. Di conseguenza un aumento della trascrizione di questi geni potrebbe non corrispondere ad un incremento della cinetica di reazione se non aumentano anche i fattori necessari per l’attività dell’enzima E3. Viceversa, una riduzione dell’espressione delle ubiquitina-ligasi comporta una diminuzione della degradazione proteica che si manifesta con un minor grado di atrofia. Un altro fattore che dobbiamo tener presente e che potrebbe avere un peso nell’interpretazione dei risultati è che acetilazione ed ubiquitinazione convergono, potenzialmente, sugli stessi residui di lisina. Quindi la mutazione dei residui acetilabili di lisina in forme non più acetilabili potrebbe avere influenze sul processo di ubiquitinazione. Nello specifico è possibile che la mono-ubiquitinazione partecipi in quei residui come meccanismo di controllo dell’attività di FoxO in senso positivo, ad esempio stabilizzando la proteina. La mutazione delle lisine che potrebbero venir modificate con la mono-ubiquitinazione priverebbe questi mutanti di un controllo positivo, spiegando i risultati visti per i mutanti lisina-arginina. Effettuando questi esperimenti ci siamo accorti che i mutanti in cui tutti e sei i siti erano mutati in glutamina, che mimavano quindi lo stato di iperacetilazione, tendevano a localizzarsi nel citoplasma delle fibre trasfettate, facendoci supporre che questa modificazione andasse ad influire anche sulla traslocazione della proteina oltre che sull’attività trascrizionale. Inoltre abbiamo notato che la quantità di fibre trasfettate con questo mutante era notevolmente inferiore rispetto a quanto visto per gli altri mutanti. Questa osservazione ci ha fatto supporre che la localizzazione citoplasmatica di FoxO3 fosse un prerequisito per una successiva degradazione. Effettuando esperimenti a tempi inferiori e con l’utilizzo di inibitori del proteasoma abbiamo verificato la veridicità di questa ipotesi. Infine abbiamo analizzato se questi fenomeni si verificassero anche nella forma endogena di FoxO3, utilizzando la denervazione come modello di atrofia muscolare. Abbiamo eseguito degli esperimenti di immunoprecipitazione per analizzare come questi eventi di modificazione si evolvessero nel tempo e quello che abbiamo potuto vedere è che l’aumento dei livelli di acetilazione e di ubiquitinazione di FoxO3 correlava con la diminuzione della quantità di proteina, spiegando in maniera esaustiva i meccanismi che portano alla fine dell’attività di questa proteina. In conclusione questo lavoro di tesi fornisce un quadro completo sulle modificazioni post-traduzionali che regolano il fattore di trascrizione FoxO3 durante tutto il processo di atrofia muscolare. Questi dati forniscono una solida base per lo studio di nuovi farmaci capaci di agire in maniera mirata sulla funzione di FoxO3, limitandone i possibili effetti