Ruolo della via di segnale di Wnt5a nel fenotipo dei miofibroblasti sub-epiteliali intestinali in corso di Colite Ulcerosa

ABSTRACT Background: Wnts are a highly conserved family of secreted glicoproteins involved in several physiological and pathological processes. Intestinal subepithelial myofibroblasts (ISEMFs), a cellular population releasing growth factors and cytokines involved in tissue remodelling, have been recently identified as a source of Wnts ligands. Since Wnt5a, the main ligand of the non-canonical pathway, plays a pivotal role in intestinal epithelial repair and is up-regulated in chronic inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis, the aim of our study was to evaluate, in ISEMFs derived from normal subjects and ulcerative colitis (UC) patients, the expression of Wnt5a and its receptors and determine its autocrine role on ISEMFs. Methods: ISEMFs were isolated from colonic mucosa of healthy subjects (n=6) or from patients with UC (n=10). Wnt5a and Frzd1, 2, 4, 5 expressions was evaluated by quantitative RT-Time PCR and Western Blot. To determine the autocrine effect of Wnt5a, we performed functional studies using Wnt5a KO by shRNA or exposing ISEMFs to human recombinant Wnt5a. Following 96 hours culture, cell proliferation was quantitated by 3H-tymidine incorporation and cell cycle analysis. To evaluate anti-apoptotic role of Wnt5a, we performed functional studies exposing ISEMFs to human recombinant Wnt5a and staurosporin. Following 24 hours culture Annexin V and caspase-3 assay was estimated. To identify pathway induced by Wnt5a signal, functional studies using β-catenin KO by shRNA or exposing ISEMFs to Ca2+ inhibitors was performed and CamKII protein levels was measured by Western blot. Results: UC-derived ISEMFs showed a significantly higher Wnt5a expression at mRNA and protein level (p<0.05) in basal condition as compared to controls. Furthermore, as compared to controls UC-derived ISEMFs produced significantly higher amounts of Wnt5a following exposure to LPS or TGFβ (p<0.05). ISEMFs derived both normal and UC patients showed a similar pattern of Wnts receptors. Wnt5a silencing in UC-derived ISEMFs and in control ISEMFs, caused a significant reduction in cell proliferation (p<0.05). Indeed, rWnt5a supplementation stimulated cell proliferation and resistance to staurosporin induced-apoptosis. Wnt5a signal is β-catenin independent because supplementation of rWnt5a in KO β-catenin ISEMFs led to a significative increase of cell proliferation (p<0.05). On the contrary,Wnt5a signal seems to be mediated by CamKII, promoting an increase of its phosphorilation. Conclusions: ISEMFs from UC patients produce an excess of Wnt5a that is able to stimulate cellular proliferation, resistance to apoptosis and that acts by CamKII activation. We speculate that Wnt5a plays a key role to expand the ISEMFs population in UC patients and might contribute to tissue damage and remodeling during chronic inflammation.

Wnt5a rappresenta il ligando prototipo della via non canonica di Wnt, via di segnale coinvolta nei processi di embriogenesi, riparazione tissutale e carcinogenesi dell’epitelio intestinale. Fisiologicamente, Wnt5a agisce sulla migrazione e proliferazione di tipi cellulari diversi coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi epiteliale, fungendo da mediatore nel dialogo tra epitelio e mesenchima. Numerosi dati sperimentali suggeriscono inoltre che l’aumento di Wnt5a possa essere un meccanismo comune dell’infiammazione cronica in quanto è sovra-espresso nell’artrite reumatoide, nell’aterosclerosi e nella psoriasi. Abbiamo pertanto iniziato ad esaminare il ruolo di Wnt5a nell’infiammazione cronica intestinale. Il modello preso in esame è rappresentato da miofibroblasti subepiteliali intestinali (ISEMFs) da Rettocolite Ulcerosa (RCU). Le ISEMFs sono cellule coinvolte nell’omeostasi intestinale: nell’intestino rappresentato il maggior sito di produzione del collagene e di altre proteine della matrice extracellulare, promuovendo dunque il rimodellamento tessutale. Inoltre interagiscono con le cellule epiteliali, le staminali e i macrofagi promuovendo e la restituzione epiteliale e la secrezione di citochine e chemochine. Si è osservato che nella mucosa dei pazienti affetti da IBD, il numero di queste cellule è significativamente aumentato rispetto a quello della mucosa sana, e che un’alterazione della loro funzionalità è coinvolto nella fisiopatologia delle IBD. L’aumentata espressione di Wnt5a a livello trascrizionale e proteico è stata verificata in soggetti affetti da RCU, con correlazione diretta con il grado di attività di malattia. Studi di immunoistochimica hanno permesso, mediante co-localizzazione con α-SMA, di osservare la distribuzione di Wnt5a nel tessuto e la sua preponderante espressione in miofibroblasti sub epiteliali. La caratterizzazione di Wnt5a è stata dunque effettuata su miofibroblasti primari estratti da mucosa di Rettocolite Ulcerosa e tessuto controllo. Cellule derivate da tessuto infiammato hanno mostrato maggiori livelli di espressione proteica di Wnt5a. Dosaggi del trascritto e western blotting hanno permesso di osservare che il TGFβ e LPS sono in grado promuovere una sovra-espressione di Wnt5a nei miofibroblasti intestinali. Abbiamo quindi condotto dei saggi per verificare se Wnt5a regolasse caratteristiche fisiologiche e fenotipiche nelle ISEMFs stesse. A tal fine,dopo aver verificato la presenza dei recettori per Wnt5a, abbiamo iniziato degli studi di tipo funzionale mediante RNA interference (RNAi) per lo spegnimento genico (loss of function); perciò abbiamo messo a punto la metodica per il Knockdown di Wnt5a in colture primarie di ISEMFs con vettori adenovirali codificanti shRNA. Viceversa sono stati condotti degli studi di gain of function supplementando al terreno di coltura cellulare la proteina purificata rWnt5a. Sono stati effettuati dei saggi proliferazione rilevata mediante il metodo dell’incorporazione della timidina triziata da cui emerso che nelle ISEMFs Wnt5a promuove la proliferazione. Inoltre sono stati effettuati dei saggi sul ciclo cellulare mediante colorazione di ioduro di propidio e di resistenza all’apoptosi mediante anessina V e test di attivazione della caspasi-3, da cui emerge che questa glicoproteina promuove la sopravvivenza cellulare. Complessivamente questi dati sembrano indicare che Wnt5a ha il ruolo di promuovere l’espansione e il mantenimento di questo tipo cellulare e quindi di perpetuare il danno tissutale e l’infiammazione cronica intestinale in RCU.