Outer membrane particles as Shigella vaccine candidate: generation, proteomic and immunoproteomic analysis

Shigellae are Gram-negative enteric bacteria representing the major cause of dysenteric diseases in infants and young children in developing countries. The genus Shigella comprises 50 different serotypes characterized by the carbohydrate composition of the O-antigen of the lipopolysaccharide. In natural infection the immune response to the O-antigen has been shown to be protective but serotype-specific, and no vaccine against Shigella is currently available. Novartis Vaccines Institute for Global Health (NVGH) aims to develop a broadly protective protein-based vaccine using outer membrane particles. These particles, called Generalized Modules for Membrane Antigens (GMMA), also known as outer membrane vesicles (OMV), are naturally shed from the surface of Gram-negative bacteria and expose the host to proteins of the outer membrane in their native orientation. They are different from detergent-extracted OMV which are depleted of lipooligosaccharides and lipoproteins. As Shigella naturally produce low amounts of GMMA, the tolR gene was deleted to induce GMMA overproduction. To avoid immuno-dominant immune responses to the O-antigen, the genes of the O-antigen biosynthesis gene cluster were deleted. In addition, the msbB gene was deleted to reduce the endotoxicity of the lipopolysaccharide (LPS). GMMA were generated under iron-restricted conditions to induce the expression of highly conserved iron siderophore receptors that have been shown to be protective antigens against Salmonella infection. The proteomics analysis of S. sonnei 53G and S. flexneri 2a 2457T GMMA confirmed that GMMA are highly enriched in outer membrane and periplasmic proteins. Approximately 65% and 71% of the total predicted outer membrane proteins of S. flexneri and S. sonnei, respectively, and 50% of the total predicted periplasmic proteins were found to be present in GMMA. In contrast, only 4% of the total predicted cytoplasmic proteins were indentified in GMMA. We identified 50 outer membrane proteins and 2 predicted extracellular proteins that were conserved in S. sonnei and S. flexneri GMMA. Among these proteins we identified 3 proteins encoded on the virulence plasmid (MxiD, MxiM and IcsA/VirG), and other 3 proteins with a virulence-associated function (SepA, SigA and TieB) which are specific for Shigella and pathogenic E. coli. The proteomic results also confirmed the overexpression of 8 iron-regulated proteins in GMMA of which 5 are conserved in S. sonnei and S. flexneri. Mice were immunized using purified GMMA and immune sera were analyzed by ELISA and bi-dimensional Western blots. All GMMA elicited similarly high levels of total GMMA-specific IgG. By 2 dimensional Western blots (2-D WB) analysis mainly periplasmic proteins and only 3 outer membrane proteins were identified, suggesting that a different approach was needed to identify outer membrane proteins in their native conformation. In this work we present a novel approach to identify immunogenic surface proteins based on immunoprecipitation studies with live bacteria using sera raised against GMMA. We identified 30 immunogenic surface proteins and among those we found OmpA, OmpX and YaeT confirming our previous 2-D WB results. In addition, we identified proteins that were not found by 2-D WB but are known to be immunogenic in Shigella, e.g. TolC, supporting the power of this approach. Furthermore, OmpC, FepA, FhuA, and CirA were identified using this approach suggesting that the native conformation of the epitopes is important for antibody binding and that these epitopes are lost by 2-D WB analysis. A quantitative proteomic analysis of GMMA proteomes, based on stable isotope dimethyl labeling followed by GeLC-MS/MS, revealed that the majority of the 30 immunogenic proteins are the most abundant proteins in GMMA. Interestingly, YiaD, YtfM and one of the iron-regulated proteins, FepA, raised a strong antibody response but are of low abundance in GMMA. The majority of the immunogenic proteins identified in S. sonnei are also present and highly conserved in S. flexneri GMMA. Thus, it is likely that these proteins might raise cross-reactive immune responses. The present work shows for the first time an extensive qualitative and quantitative proteomic analysis of Shigella GMMA. In addition, the analysis of immunogenic surface proteins under native conditions identified proteins that are highly conserved among Shigella serotypes. This work provides the basis for further characterization of GMMA as a protein-based vaccine against Shigella

La Shigella è un batterio enterico Gram-negativo e rappresenta la principale causa di dissenteria nei neonati e nei bambini al di sotto dei 5 anni nei paesi in via di sviluppo. Il genere Shigella include 50 serotipi diversi distinguibili in base alla composizione saccaridica dell’antigene O del lipopolisaccaride (LPS). Nell’infezione naturale è stato osservato che l’antigene O è in grado di indurre una risposta immunitaria protettiva contro l’infezione da Shigella, ma tale risposta risulta essere specifica contro i singoli serotipi. Non ci sono al momento vaccini disponibili per prevenire l’infezione da Shigella. L’istituto “Novartis Vaccines Institute for Global Health” (NVGH) sta lavorando su un progetto per lo sviluppo di un vaccino proteico protettivo e ad ampio spettro per la prevenzione di infezioni da Shigella basato sull’utilizzo di particelle di membrana esterna. Queste particelle, chiamate Moduli Generalizzati per l’espressione di Antigeni di Membrana (GMMA) e comunemente conosciute in letteratura come vescicole di membrana esterna (OMV), sono naturalmente rilasciate dalla superficie dei batteri Gram-negativi e presentano all’ospite le proteine della membrana esterna nella loro conformazione originaria. Queste particelle si distinguono dalle OMV ottenute mediante estrazione con detergenti che sono prive di lipo-oligosaccaridi e lipoproteine. Poiché Shigella rilascia naturalmente piccole quantità di GMMA, è stata eseguita una delezione del gene tolR al fine di indurre un maggior rilascio di GMMA. Per abolire la risposta immunitaria serotipo-specifica dell’antigene O è stata eseguita una delezione del cluster di geni codificanti per l’antigene O. Una successiva delezione del gene msbB è stata effettuata per ridurre la reattogenicità delle molecole di LPS. Le GMMA sono state ottenute crescendo i ceppi produttori in condizioni limitanti di ferro al fine di indurre l’espressione di recettori del ferro molto conservati in Shigella. Tali recettori si sono dimostrati antigeni protettivi contro l’infezione da Salmonella. L’analisi delle GMMA di S. sonnei 53G e S. flexneri 2a 2457T attraverso approccio proteomico ha confermato che le GMMA contengono prevalentemente proteine di membrana esterna e proteine periplasmatiche. Nelle GMMA abbiamo identificato circa il 65% e il 71% delle proteine di membrana esterna predette in totale rispettivamente in S. flexneri e in S. sonnei e il 50% delle proteine periplasmatiche. Le proteine citoplasmatiche identificate nelle GMMA rappresentano, invece, solamente il 4% delle proteine citoplasmatiche totali predette. Abbiamo identificato 50 proteine di membrana esterna e 2 proteine con predizione extracellulare conservate nelle GMMA di S. sonnei e di S. flexneri. Tra le proteine comuni abbiamo identificato 3 proteine codificate dal plasmide di virulenza (MxiD, MxiM and IcsA/VirG) e altre 3 proteine con una funzione associata alla virulenza (SepA, SigA and TieB) che sono specifiche per Shigella e ceppi patogeni di E. coli. I risultati dell’analisi proteomica hanno inoltre confermato l’overespressione di 8 proteine ferro-regolate nelle GMMA, di cui 5 sono conservate in S. sonnei e S. flexneri. Le GMMA sono state utilizzate per l’immunizzazione di topi e i sieri immuni sono stati analizzati mediante saggi ELISA e Western blots bi-dimensionali (2-D WB). Tutte le GMMA testate hanno stimolato in modo equiparabile la produzione di alti livelli di immunoglobuline di tipo G (IgG) GMMA-specifiche. Dalle analisi di 2-D WB abbiamo identificato proteine immunogeniche prevalentemente periplasmatiche e solo 3 proteine di membrana esterna. Tali risultati hanno suggerito la necessità di trovare un approccio alternativo per l’identificazione di proteine di membrana esterna nella loro conformazione nativa. In questo studio presentiamo un approccio per l’identificazione di proteine immunogeniche di superficie basato su studi di immunoprecipitazione su batteri vivi usando sieri immuni specifici contro le GMMA. Abbiamo identificato 30 proteine immunogeniche di superificie e tra queste abbiamo trovato OmpA, OmpX e YaeT confermando i risultati precedentemente ottenuti mediante 2-D WB. Inoltre, abbiamo identificato proteine che sono riportate immunogeniche in Shigella, come ad esempio TolC, ma che non sono state rilevate mediante 2-D WB supportando l’efficacia di questo approccio. L’ulteriore identificazione delle proteine OmpC, FepA, FhuA e CirA mediante immunoprecipitazione suggerisce che la conformazione nativa degli epitopi è importante per il legame con l’anticorpo e che tali epitopi vengono persi nelle analisi di 2-D WB. Un’analisi proteomica di tipo quantitativa delle GMMA, basata sull’utilizzo di marcatura isotopica stabile con legame dimetilico seguita da GeLC-MS/MS, ha rivelato che la maggior parte delle 30 proteine immunogeniche sono anche le proteine più abbondanti nelle GMMA. E’ interessante notare che nonostante YiaD, YtfM e una delle proteine ferro-regolate (FepA) siano tra le proteine meno abbondanti nelle GMMA, tali proteine hanno indotto una forte risposta immunitaria. La maggior parte delle proteine immunogeniche identificate in S. sonnei sono anche presenti e altamente conservate nelle GMMA di S. flexneri. Perciò, è molto probabile che queste proteine siano in grado di indurre una risposta immunitaria cross-reattiva. Il presente studio mostra per la prima volta un’estensiva analisi proteomica di tipo qualitativa e quantitativa delle GMMA ottenute da Shigella. Inoltre, l’analisi delle proteine immunogeniche di superficie condotta in condizioni native ha permesso di identificare proteine altamente conservate tra i serotipi di Shigella. Questo lavoro fornisce le basi per una successiva caratterizzazione delle GMMA come vaccino a base proteica contro Shigella