Molecular and physiological mechanisms of stress signalling in plants.

The aim of this PhD research project was the understanding of some molecular and physiological mechanisms involved in stress signalling in plants. When plants are exposed to environmental growth conditions far from the ideals, plants are under stress. Under stress conditions, plant growth and crop yield could be severely affected. In general, adverse growth conditions are caused by plant pathogens (biotic stress) and not ideal environmental conditions (abiotic stress) such as heat, cold, drought, lack of nutrients, and heavy metals. Plants experiencing biotic and abiotic stresses activate signalling pathways that lead to changes in gene expression, thus, alteration of transcriptome, proteome and metabolome. All these processes are oriented to the acclimation of plants to the changed growth conditions. During my PhD I approached the study of two stress signalling mechanisms, one occurring as consequence of high concentration of cytokinins (CKs), a physiopathological condition (biotic stress), and the other one as consequence of cadmium-induced oxidative stress (abiotic stress). Concerning the first signalling pathway, I investigated the involvement of CK receptors in triggering the programmed cell death (PCD) signalling in Arabidopsis thaliana cell cultures treated with high concentrations of CKs. In order to do so, we generated cell culture lines from wild-type and three Arabidopsis mutants, knocked-out in genes coding for different CK receptors (cre1-2, ahk2-5 ahk3-7 and ahk2-5 ahk3-7 cre1-2). Then, we characterized some physiological parameters of these cell cultures; in particular, we determined the growth and death kinetics, and the CKs content. No evident differences in the growth and death kinetics of wild-type, single and double mutant cell culture lines were observed, except for a delay in increasing cell death in the late part of the triple mutant subculture cycle. Moreover, the levels of most CKs resulted increased to a different extent in the CK receptor mutant lines. Then, in order to define whether the CK-induced PCD mechanisms required the functionality of the CK receptors, wild-type and mutant cell cultures were assayed for their sensitivity to high concentrations of CKs. The results of these experiments revealed that the CRE1/AHK4 was the CK-receptor involved in triggering the PCD signals in Arabidopsis cell cultures exposed to high concentrations of CKs. Concerning the second signalling pathway, the role of Arabidopsis cytosolic GAPDH (GAPC-1 and GAPC-2) in cadmium-induced oxidative stress signalling was investigated. To this aim, Arabidopsis seedlings were exposed to cadmium, and I demonstrated that the levels of both nitrogen oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) increased leading to the induction of an oxidative stress condition. Under these stress conditions the up-regulation of both GAPC-1 and GAPC-2 occurred. Given that, the more affected gene was GAPC-1, I produced Arabidopsis transgenic lines expressing GAPC-1 transcriptional and translational reporters. The exposure of these transgenic lines to cadmium revealed that GAPC-1 is affected by oxidative stress both at the transcriptional and post-transcriptional levels. Moreover, in vitro analyses revealed that NO and H2O2 negatively affected the GAPDH catalytic activity in a time- and concentration-dependent manner. These results confirmed that the oxidative stress condition induced by the accumulation of NO and H2O2 can affect the catalytic activity of the GAPC-1 enzyme, activating a signal cascade that enhances its expression and then its accumulation. Furthermore, reducing the redox state with reduced glutathione restored the catalytic activity of the NO-inactivated recombinant GAPC-1, and also reduced the GAPC-1 promoter activity and GAPC-1 protein level in vivo. On the other hand, decreasing the glutathione pool in vivo (i.e. more oxidizing condition) led to the increase of GAPC-1 promoter activity and GAPC-1 protein level. Finally, prolonged oxidative stress conditions led to the GAPC-1 nuclear accumulation. All together these results demonstrate that GAPC-1 is an oxidative stress sensor, and its nuclear relocalization could be a key step in the oxidative stress signalling. The study of how plants perceive stress conditions, the mechanisms by which plants transmit stress signals, and finally the acclimation to adverse growth conditions could be important to understand how to reduce the negative effects of biotic and abiotic stresses on plant growth and ultimately crop yield.

Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato lo studio dei meccanismi molecolari e fisiologici coinvolti nella trasduzione dei segnali di stress nelle piante. Quando le piante sono esposte a condizioni ambientali di crescita non ideali, si trovano in condizioni di stress. In queste condizioni, la crescita delle piante e la resa delle colture d’interesse agronomico sono di solito fortemente ridotte. In generale, le condizioni di crescita sfavorevoli sono causate da agenti patogeni (stress biotici) e da condizioni ambientali non ideali (stress abiotici) come caldo, freddo, siccità, carenza di nutrienti e metalli pesanti. Le piante esposte a stress biotici e abiotici attivano vie di segnalazione che inducono il cambiamento dell'espressione genica, quindi, l'alterazione del trascrittoma, proteoma e metaboloma. Tutti questi processi sono orientati all’acclimatazione delle piante alle condizioni di crescita avverse. Durante il mio dottorato di ricerca ho affrontato lo studio di due meccanismi di segnalazione dello stress, uno che si verifica in seguito ad esposizione ad elevate concentrazioni di citochinine (CKs), una condizione fisiopatologica (stress biotici), e l'altro in risposta a stress ossidativo indotto da alte concentrazioni di cadmio (stress abiotici). Per quanto riguarda il primo meccanismo di segnalazione, ho studiato il ruolo dei recettori citochininici nella via di segnalazione e induzione della morte cellulare programmata (PCD) in colture cellulari di Arabidopsis thaliana trattate con alte concentrazioni di CKs. Per far ciò, abbiamo generato colture cellulari da una linea wild-type e da tre linee mutanti (knock-out) di Arabidopsis, in geni che codificano per diversi recettori citochininici (cre1-2, ahk2-5 ahk3-7 e ahk2-5 ahk3-7-cre1-2). In seguito, abbiamo caratterizzato alcuni parametri fisiologici di queste colture cellulari, in particolare, abbiamo determinato la crescita e la cinetica di morte e il contenuto di CKs. Non sono state riscontrate differenze evidenti nelle cinetiche di crescita e morte tra cellule wild-type, e linee cellulari mutanti, ad eccezione di un ritardo nella morte cellulare nelle ultime fasi del ciclo di coltura del triplo mutante. Inoltre, sono stati misurati livelli più elevati di CKs nelle linee cellulari mutanti. Infine, per verificare se i recettori citochininici fossero coinvolti nell’induzione della PCD in seguito al trattamento con alte concentrazioni di CK, è stata analizzata la risposta delle colture cellulari wild-type e mutanti ad alte concentrazioni di CKs. I risultati di questi esperimenti hanno rivelato che il recettore CRE1/AHK4 sia quello coinvolto nel meccanismo di segnalazione e induzione della PCD in colture cellulari di Arabidopsis esposte ad alte concentrazioni di CK. Per quanto riguarda il secondo meccanismo di segnalazione, ho studiato il ruolo delle GAPDH citosoliche (GAPC-1 e GAPC-2) di Arabidopsis nelle vie di segnalazione indotte da stress ossidativo in presenza di alte concentrazioni di cadmio. A tal fine, sono state trattate piantine di Arabidopsis con alte concentrazioni di cadmio e i risultati hanno mostrato che tale trattamento induceva un aumento dei livelli di ossido nitrico (NO) e perossido d’idrogeno (H2O2), e tale aumento causava l’induzione di una condizione di stress ossidativo. In queste condizioni di stress si è osservato un aumento dell’espressione di entrambi i geni GAPC. Essendo GAPC-1 il gene che mostrava l’aumento di espressione maggiore, ho prodotto delle linee transgeniche di Arabidopsis che esprimevano stabilmente geni reporter trascrizionali e traduzionali per GAPC-1. L'esposizione di queste linee transgeniche al cadmio ha rivelato che GAPC-1 è influenzata dallo stress ossidativo sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. Inoltre, dalle analisi in vitro si è osservato che NO e H2O2 influenzavano negativamente l'attività catalitica GAPDH in modo tempo- e concentrazione-dipendente. Questi risultati hanno confermato che le condizioni di stress ossidativo indotte da un aumento delle concentrazioni di NO e di H2O2 possono influenzare l'attività catalitica di GAPC-1, attivando una via di segnalazione che porta a un aumento della sua espressione e quindi il suo accumulo. Riducendo lo stato redox con il glutatione ridotto, l'attività catalitica della GAPC-1 ricombinante inattivata dal trattamento con NO si ripristinava. Inoltre, la presenza di glutatione ridotto riduceva sia l’attività promotoriale di GAPC-1 che i livelli di GAPC-1 in vivo. Peraltro, riducendo il contenuto di glutatione in vivo (quindi imponendo una condizione più ossidante) si è osservato l'aumento dell’attività promotoriale di GAPC-1 ed un aumento dei livelli di GAPC-1. Infine, prolungate condizioni di stress ossidativo hanno portato all’accumulo di GAPC-1 all’interno del nucleo. Questi risultati dimostrano che GAPC-1 è un sensore di stress ossidativo, e la sua rilocalizzazione nucleare potrebbe essere un passaggio chiave per la segnalazione dello stress ossidativo. Lo studio di come le piante percepiscano le condizioni di stress, i meccanismi con cui le piante trasmettono segnali di stress, ed infine lo studio dei meccanismi di acclimatazione a condizioni di crescita sfavorevoli potrebbe aiutare ad intervenire per ridurre gli effetti negativi di stress biotici e abiotici sulla crescita delle piante e sulla resa delle colture di interesse agronomico.