Studi di immunogenicità ed efficacia di vettori HSV per lo sviluppo di un vaccino contro l'infezione da Herpes Simplex

Introduction Herpes simplex virus (HSV) is a relevant human pathogen widespread in the human population worldwide. The virus multiplies in the epithelial cells at the portal of entry, infects sensory nerve endings innervating the site of multiplication, where it establishes a latent infection. HSV-1 and HSV-2 genotypes can cause a variety of recurrent clinical illnesses including cold sores, keratitis, meningitis, encephalitis and genital infections that are characterized by pain, ulceration and increased risk of developing cervical cancer and acquiring other sexually transmitted infections, including HIV infection. In the last, 30 years several studies were devoted to the development of anti-HSV vaccines. Unfortunately, and in spite of numerous attempts with recombinant non-replicating viral vectors based on HSV, Adenovirus, vaccinia virus, recombinant HSV glycoproteins, attenuated live viruses, no anti-HSV vaccine is still available. Identification of adjuvants that can promote Th1 immune response induction, not only against dominant epitopes but also against subdominant epitopes, is a key point for the development of novel vaccine strategies against HSV infection. Aim In the present study, we describe the construction and the in vitro and in vivo characterization of a replication-defective or non-replicative HSV-1-based vectors deleted of multiple immediate early regulatory genes and containing a deletion in the non essential UL41 locus. We investigated the ability of a recombinant replication-defective or non replicative HSV-1 vectors encoding the HIV-1 Tat protein to induce long-term HSV-specific immune responses in a murine model. In this context, in the present study we have investigated whether the HIV-1 Tat protein may act as the molecule capable of inducing such broad and protective immunity against HSV. The ability of the vectors ( HSV1-Tat or HSV1-LacZ, HSVTB5gJTat or HSVTB5gJHE) to elicit protective immune responses in Balb/C and C57BL/6 mice upon challenge with wild-type HSV-1 or HSV-2 will be described. Method Generation of recombinant replication-defective or non replicative HSV-l vectors, Western blot analysis, virus stock purification, immunization protocols, splenocyte purification, Elispot assay, ELISA assay. Results The replication-defective or non-replicative HSV-1 vectors mantain the capacity to infect both dividing and non dividing cells of different species. They are safer compare to wild-type herpes virus because they are anable to replicate. The results indicate that Tat plays a major role in conferring protective immune-responses against HSV infection in both mice strains since only mice primed with the live attenuated (HSV1-Tat) or non replicative (HSVTB5gJTat) vectors, were protected from death after receiving a lethal dose of wild-type HSV-1 or HSV-2. The vectors administration by the intravaginally or intradermic route elicit specific immune responses in mice, mediating an increase of anti-HSV cellular immune responses characterized by the presence of high levels of IFN-γ. Moreover the vectors mediate an increase of anti-HSV humorale immune responses, as compared to control (HSV1LVLacZ) vector, characterized by the presence of high levels IgG, subtype IgG2a. This work demonstrates that HSV recombinant vectors and HIV Tat protein, selected for this study, can be combined to increase and broad Th1-like and CTL responses against HSV epitopes. Our results indicate that the co-expression of Tat protein is important to induce a protective response in both mice strain even if the responses are different depending on the genetic background. In these mice stronger and broader immune responses against HSV subdominant epitopes are crucial for protection from death. Conclusion This study shows that the replicative or non replicative vectors expressing Tat are safe since no adverse effects were observed during the experimental protocols. These outcomes are very promising for the development of a novel generation of effective HSV vaccines.

Introduzione Herpes simplex virus (HSV) è un patogeno molto diffuso nella popolazione mondiale umana. Il virus utilizza le cellule epiteliali come portale d'ingresso, in tali cellule replica e raggiunge le terminazioni nervose, nelle quali instaura la latenza. I due genotipi HSV-1 e HSV-2 possono causare diverse patologie cliniche, compresi l’ herpes labiale, cheratiti, meningiti, encefaliti e infezioni genitali, caratterizzate da dolore, ulcere e aumento del rischio di sviluppare il cancro del collo dell'utero e l'acquisizione di altre infezioni sessualmente trasmissibili, tra cui l'infezione da HIV. Negli ultimi 30 anni diversi studi sono stati dedicati allo sviluppo di vaccini anti-HSV. Purtroppo, e nonostante numerosi tentativi, un vaccino anti-HSV non è ancora disponibile. Per la realizzazione del vaccino sono stati proposti e sperimentati diversi sistemi: Adenovirus, vaccinia virus, virus ricombinanti esprimenti le glicoproteine di HSV, virus vivi attenuati, ma nessuno a portato ai risultati sperati. L’identificazione di adiuvanti in grado di promuovere dei segnali atti a favorire l'emergere di una risposta immunitaria Th1 non solo contro epitopi dominanti, ma anche contro epitopi subdominanti, che sono cruciali per bloccare la riattivazione virale è un punto chiave per lo sviluppo di nuove strategie di vaccino contro l'infezione da HSV. Scopo In questo studi l’obiettivo principale è stato quello di costruire e caratterizzare in vitro e in vivo dei vettori HSV a replicazione attenuata e non replicativi deleti di più geni regolatori precoci e/o contenenti una delezione del locus non essenziali UL41. Abbiamo studiato la capacità di vettori replicativi e non di codificare per la proteina Tat di HIV-1, per indurre risposte immunitarie HSV-specifiche a lungo termine in un modello murino. In questo contesto, abbiamo valutato se la proteina Tat di HIV-1 potesse agire come molecola in grado di generare un immunità ad ampio spettro contro l’infezione da HSV. Inoltre è stata valutata la capacità dei vettori (HSV1-Tat o HSV1-LacZ, HSVTB5gJTat o HSVTB5gJHE) di indurre una risposta immunitaria protettiva nei topi Balb/C e C57BL/6 in seguito ad un infezione con una dose letale di HSV-1 o HSV-2 wild-type. Metodi Costruzione e Caratterizzazione dei vettori replicativi attenuati e non replicativi, Colture cellulari, Analisi Western Blot, Purificazione di stock virali, Animali e protocolli di immunizzazione, Purificazione degli splenociti, Saggio Elispot, Saggio ELISA. Risultati I vettori HSV replicativi attenuati e non replicativi conservano la capacità di infettare cellule in divisione e non di diverse specie, comportandosi come virus wild-type, ma risultano più sicuri a causa della loro incapacità di replicare e esprimere proteine virali dopo l'infezione. I risultati indicano che la proteina Tat svolge un ruolo importante nel conferire protezione immunitaria contro l'infezione da HSV in entrambi i ceppi di topi in quanto solo i topi vaccinati con i vettori replicativi attenuati (HSV1-Tat) o non replicativi (HSVTB5gJTat) esprimenti Tat risultavano protetti dalla morte dopo aver ricevuto una dose letale di HSV-1 o HSV-2 wild-type. La somministrazione dei vettori per via intravaginale o intradermica genera specifiche risposte immunitarie nei topi, media un incremento della risposta cellulare anti-HSV caratterizzata dalla presenza di alti livelli di IFN-γ, un incremento della risposta umorale anti-HSV rispetto al vettore di controllo (HSV1LVLacZ) caratterizzato dalla presenza di elevati livelli di IgG, più precisamente del sottotipo IgG2a. Questo lavoro dimostra che i vettori HSV associati alla proteina ricombinante Tat di HIV possono essere combinati per aumentare e ampliare la risposta di tipo Th1 e CTL contro epitopi immunodominanti e subdominanti di HSV. I nostri risultati indicano che la co-espressione della proteina Tat è importante per indurre una risposta protettiva in entrambi i modelli murini scelti, anche se le risposte sono diverse a seconda del background genetico. In questi topi la risposta immunitaria contro epitopi subdominanti di HSV è risultata essere fondamentale per una indurre una maggiore protezione Conclusione Questi studi indicano che l’utilizzo di vettori replicativi attenuati e non replicativi di HSV esprimenti la proteina Tat sono sicuri, in quanto non hanno mostrato effetti avversi durante gli esperimenti e al sacrificio. Questi risultati sono molto promettenti per lo sviluppo di una nuova generazione di vaccini efficaci HSV.