Gcn4 misregulation reveals a novel role for EKC/KEOPS complex in the t6A37 tRNAs modification

The yeast EKC (Endopeptidase-like and Kinase associated to transcribed Chromatin)/KEOPS (Kinase, Endopeptidase and Other Proteins of small Size) complex is composed of five subunits: three small proteins (Pcc1, Pcc2, Cgi121, without known enzymatic signatures), the atypical protein kinase Bud32, and Kae1, whose actual function remains unknown. With the only exception of Pcc2 subunit, which is restricted to Fungi, the whole EKC/KEOPS complex is conserved in Archaea and Eukarya, while Kae1, the most conserved and ancient member of the complex, shows clear orthologs also in Bacteria. Although this complex has been implicated in several cellular processes, including transcription, telomere homeostasis and genomic stability maintenance, its precise mechanism of action or detailed molecular function has never been described so far. My PhD research work has been part of a broad network of collaborations aimed to elucidate the molecular mechanism(s) of action of the complex, adopting several different approaches and using Saccharomyces cerevisiae as model organism. At the beginning of my PhD, several data indicating Kae1 as a Bud32 substrate were available, and I was involved in the study of this enzyme/substrate relationship. In particular, I tried to define the importance and the physiological role of the phosphorylation of Kae1 at Ser367, identified by MS analyses as one of the Kae1 residues phosphorylated by Bud32. Results of an in vitro kinase assay, performed using a recombinant Kae1 mutant protein not phosphorylatable at position 367 as substrate of a recombinant Bud32 kinase, together with the phenotypic analysis of the yeast kae1-S367A mutant strain, showed that Serine367 is not the principal residue of Kae1 phosphorylated by Bud32. To identify and define the importance of other Kae1 residues phosphorylated by Bud32, further analyses will be required. In parallel, transcriptome analyses of EKC/KEOPS mutants (performed by the group directed by Frank Holstege) revealed a specific profile of upregulated genes that is highly enriched in targets of the Gcn4 transcriptional activator. Expression of GCN4, the key player of the general amino acid control, is regulated at the translational level via a well-studied mechanism of re-initiation depending on the presence of four short upstream open reading frames (uORFs 1 to 4) present in the 5’ UTR of the GCN4 mRNA. Using Gcn4-LacZ fusion reporters, we show that translation of GCN4 is derepressed in the EKC/KEOPS mutants due to the defective recognition of the inhibitory uORFs. Other collaborators and also two independent groups showed that EKC/KEOPS mutants are defective for the universally conserved N6-threonylcarbamoyl adenosine modification at position 37 (t6A37) of the anticodon stem-loop of all tRNAs decoding ANN codons, including the initiator tRNAiMet. This modification is required for proper codon-anticodon loop recognition and stability of this interaction. t6A37 defect impairs translation at different levels, in particular at the initiation step, and it is the cause of Gcn4 derepression in EKC/KEOPS mutants. These findings are further supported by strong genetic interactions of EKC/KEOPS mutants with the translation initiation factor eIF5, as well as threonine biosynthesis and tRNA metabolism genes. At this point we wondered if EKC/KEOPS complex is able to modify not only tRNAs, but also other RNA species, by the addition of a threonylcarbamoyl group to adenosine nucleotides. So I tried to re-produce a published experiment of primer extension, which correlated the absence of the t6A modification in EKC/KEOPS mutants to the disappearance/decrease of the “stop band” relative to A37, produced during the retro-transcription of an ANN-decoding tRNA primed by radioabeled oligonucleotides. The idea was that once fine-tuned the technique on a substrate already tested, I could analyze any other RNA species, choosing the appropriate oligonucleotide to extend. Even if I tested different experimental conditions, identical or comparable to those published, I never got the same result. In order to identify RNAs bound by the EKC/KEOPS complex, we chose a strategy associating RNA-immunoprecipitation (RIP) with deep-sequencing. In the final session of results, I describe the different steps of RIP experiment that we started to set up. The main finding arisen from the work presented in this thesis is that the EKC/KEOPS complex strongly impacts translation, accordingly with its direct role in tRNA modification, providing a novel twist to understanding its primary function and its impact on several essential cellular functions like transcription and telomere homeostasis

Il complesso EKC/KEOPS è costituito nel lievito da cinque subunità: tre piccole proteine (Pcc1, Pcc2 e Cgi121), di cui non sono note caratteristiche biochimiche rilevanti, Bud32, una protein chinasi atipica e Kae1, la cui funzione è sconosciuta. Fatta eccezione per Pcc2, presente solo nei Funghi, l’intero complesso EKC/KEOPS è conservato negli Archaea e negli Eucarioti, mentre Kae1, il membro più conservato e, probabilmente, più antico del complesso, presenta ortologhi anche nei Batteri. Sebbene il complesso sia implicato in diversi processi cellulari, tra cui trascrizione, omeostasi telomerica e mantenimento della stabilità genomica, il suo preciso meccanismo d’azione o la sua precisa funzione molecolare non sono mai stati descritti finora. Il mio lavoro di Ricerca svolto durante il Dottorato è inserito in una rete di collaborazioni volta ad elucidare i possibili meccanismi d’azione molecolare del complesso, adottando diversi approcci sperimentali e usando il lievito Saccharomyces cerevisiae come organismo modello. All’inizio del mio Dottorato, ho preso parte allo studio della relazione enzima/substrato che già diversi dati indicavano per Bud32 e Kae1. In particolare, ho provato a definire l’importanza e il ruolo fisiologico della fosforilazione della serina in posizione 367 di Kae1, identificata, grazie ad analisi di spettrometria di massa (MS), come uno dei residui di Kae1 fosforilati da Bud32. I risultati di un test di fosforilazione in vitro, condotto usando proteine ricombinanti, tra cui una forma di Kae1 mutagenizzata (e quindi non più fosforilabile) in posizione 367 come substrato di Bud32, assieme all’analisi del fenotipo di crescita di un ceppo di lievito mutante kae1-S367A, indicano che la serina367 non è il principale residuo di Kae1 ad essere fosforilato da Bud32. Per poter identificare e definire l’importanza di altri residui di Kae1 fosforilati da Bud32, saranno quindi necessarie ulteriori analisi. Parallelamente, l’analisi del trascrittoma di ceppi esprimenti subunità mutanti del complesso EKC/KEOPS (eseguite dal gruppo diretto da Frank Holstege), ha rivelato uno specifico profilo di geni up-regolati: fra i trascritti risultati particolarmente arricchiti sono stati identificati quelli corrispondenti ai geni bersaglio dell’attivatore trascrizionale Gcn4. L’espressione di GCN4, il principale regolatore del controllo generale degli amminoacidi, è regolata a livello traduzionale, attraverso un meccanismo di regolazione dell’iniziazione che dipende da 4 ORFs presenti nella regione 5’ UTR dell’mRNA di GCN4 (uORFs 1-4). Usando diversi reporter Gcn4-LacZ, abbiamo dimostrato che la traduzione di GCN4 è derepressa nei mutanti EKC/KEOPS, in seguito a una ridotta capacità di riconoscere le uORFs inibitorie. Altri collaboratori e anche due gruppi in modo indipendente hanno dimostrato il deficit della modificazione universalmente conservata t6A37 (una treonil-carbamoilazione del residuo di adenosina in posizione 37 di tutti i tRNA che decodificano codoni ANN, incluso il tRNA iniziatore tRNAiMet) nei mutanti EKC/KEOPS. Questa modificazione è necessaria per il corretto riconoscimento codone-anticodone e per la stabilità di questa interazione. Un difetto di t6A37 altera la traduzione a diversi livelli, in particolare la fase iniziale della traduzione, ed è la causa della derepressione di Gcn4 nei mutanti EKC/KEOPS. Ciò è inoltre supportato da dati che dimostrano l’esistenza di una forte interazione genetica tra i mutanti EKC/KEOPS e il fattore eIF5 implicato nell’inizio della traduzione, ma anche con geni coinvolti nella biosintesi della treonina o nel metabolismo dei tRNA. A questo punto, ci siamo chiesti se il complesso EKC/KEOPS sia in grado di modificare, mediante l’aggiunta di un gruppo treonil-carbamoilico all’adenosina, anche altri RNA oltre ai tRNA. Ho quindi tentato di riprodurre un esperimento di “primer extension” già pubblicato, in cui si correla l’assenza della modificazione t6A con la scomparsa/diminuzione di una banda d’arresto in corrispondenza del nucleotide A37, prodotta durante l’allungamento di un primer radiomarcato durante la retrotrascrizione di un tRNA che decodifica un codone ANN. Una volta messa a punto la tecnica usando un substrato già testato, avrei potuto analizzare qualsiasi altro tipo di RNA, scegliendo un appropriato oligonucleotide da estendere. Tuttavia, anche usando diverse condizioni sperimentali identiche o comparabili a quelle pubblicate, non sono mai riuscita ad ottenere lo stesso risultato. Allo scopo di identificare gli RNA legati dal compesso EKC/KEOPS, abbiamo scelto una strategia che associa l’immunoprecipitazione dell’RNA (RIP) al suo sequenziamento. Nella parte finale dei risultati descrivo le diverse tappe dell’esperimento RIP che ho iniziato a mettere a punto. Il risultato principale derivante dal lavoro presentato in questa tesi è la dimostrazione del coinvolgimento del complesso EKC/KEOPS nel processo di traduzione, come conseguenza del suo ruolo diretto nella modificazione t6A37 dei tRNAs. Questo risultato rappresenta una nuova svolta nella comprensione della funzione primaria del complesso e del suo impatto su diverse funzioni cellulari essenziali, tra cui la trascrizione e l’omeostasi dei telomeri