Studio del ruolo di mutazioni missenso di CDC73 e microRNA in tumori CDC73-correlati familiari e sporadici

Mutations of the CDC73 oncosuppressor gene, encoding for parafibromin, are associated with the HPT-JT syndrome, an autosomic dominant syndrome whose clinical manifestations are mainly parathyroid tumors and, less frequently, ossifying fibromas of the jaws and various types of benign or malignant uterine and renal anomalies. There are no data in the literature about CDC73 mutational status in ossifying jaw tumors from HPT-JT patients. In the present study, we identified a novel CDC73 missense substitution, Ile60Asn, in the mandibular tumor of a patient from a well-characterized HPT-JT kindred with a germline frameshift mutation in the CDC73 gene. Missense mutations of the CDC73 oncosuppressor gene are very rare and often involve residues at the N-terminal of parafibromin, whose structure and function are to date unknown. According to an in silico prediction, the Ile60Asn substitution was predicted to be pathogenetic and involved a conserved amino acid. In order to analyze in vitro the tumorigenic potential of this mutation, we performed transfection experiments in HEK293A cells to assess effects on subcellular localization, mutant protein amount, cell proliferation, apoptosis, and cyclin D1 and c-Myc expression. We demonstrated that the Ile60Asn mutant was less expressed than the wild-type protein, lacked nucleolar localization, was less able to decrease cyclin D1 expression, and increased the percentage of cells in the G2-M phases of cellular cycle. No effects were observed on c-Myc expression and on induction of spontaneous apoptosis. In conclusion, the Ile60Asn mutation exibited dominant interfering properties and not only determined production of an inactive parafibromin. The nucleolar localization of parafibromin is likely crucial to fully elicit the antiproliferative effects of parafibromin. These results indicate that ossifying fibromas of the jaw arising in patients with HPT-JT syndrome are not secondary effects of hyperparathyroidism, but occur for a second distinct mutational event in the CDC73 gene. CDC73 mutations are involved not only in familial forms of primary hyperparathyroidism; inactivating CDC73 mutations are found in 77% of sporadic malignant parathyroid tumors. A high percentage of sporadic carcinomas with CDC73 genetic anomalies shows a strong loss of immunoreactivity for parafibromin. By converse, in sporadic parathroid adenomas, CDC73 seems not to have a clear pathogenetic role: alterations in this gene are very rare (0-4%) in benign tumors. Nevertheless, in previous observations of our research group, parafibromin immunoreactivity showed great variability, with no significant difference between benign and malignant sporadic parathyroid tumors. In addition, some cases of sporadic parathyroid adenomas without CDC73 mutations with low parafibromin expression were observed. We can hypothesize the presence of mechanisms different from CDC73 mutations that might result in decrease of parafibromin expression, like down-regulation by microRNAs (miRNAs). To date, in the literature there are only two studies on miRNAs expression profile in sporadic parathyroid tumors. We performed miRNA-profiling with miRNA-microarrays on 8 sporadic parathyroid adenomas and 3 sporadic parathyroid carcinomas, in order to identify differentially expressed miRNAs. A SAM approach failed to demonstrate significantly different miRNAs in sporadic adenomas vs. carcinomas, while Gene Set Enrichment Analysis on cell pathways-associated miRNAs found an enrichment for miRNAs linked to PKC and PTEN pathway in adenomas and for miRNAs linked to SHH pathway in carcinomas. We selected for further analysis miR-9, acting in both PKC and PTEN pathways, and predicted in silico to target CDC73. Luciferase assay and western blot in HEK293A cells showed that miR-9 is able to downregulate parafibromin expression. In addition, there was an indirect effect on cyclin D1 expression, that was upregulated in cells transfected with miR-9. In paraffin-embedded sections of the tumor tissues employed for miRNA-microarray analysis, there were no correlations between miR-9 level in real-time RT PCR and parafibromin or cyclin D1 immunoreactivity. In conclusion, in sporadic parathyroid tumors we failed to demonstrate miRNAs differentially expressed between benign and malignant neoplasms. MiR-9 targets CDC73 in vitro, but in vivo it seems not to account for differences in parafibromin and cyclin D1 immunoreactivity

Mutazioni del gene oncosoppressore CDC73, codificante per parafibromina, sono associate alla sindrome da iperparatiroidismo-tumori mandibolari (HPT-JT): tale sindrome, a trasmissione autosomica dominante, è caratterizzata principalmente dall’insorgenza di tumori paratiroidei e, meno frequentemente, di fibromi ossificanti mandibolari e di vari tipi di anomalie uterine e renali, sia benigne che maligne. In letteratura non esistono dati riguardo allo stato mutazionale di CDC73 nei fibromi ossificanti mandibolari dei pazienti HPT-JT. Nel presente studio, è stata identificata una nuova mutazione somatica missenso di CDC73, Ile60Asn, nel tumore mandibolare di una paziente di una famiglia HPT-JT portatrice di una mutazione germinale frameshift di CDC73. Le mutazioni missenso di CDC73 sono molto rare, e spesso interessano residui nella porzione N-terminale di parafibromina, la cui funzione non è ancora nota. Secondo una predizione in silico, la sostituzione Ile60Asn è verosimilmente patogenetica, e altera un amminoacido altamente conservato. Per studiare in vitro il potenziale tumorigenico della mutazione, sono stati effettuati esperimenti nella linea cellulare HEK293A per analizzare possibili effetti su localizzazione subcellulare e livello di espressione della proteina mutata, proliferazione cellulare, apoptosi ed espressione di ciclina D1 e c-Myc. E’stato osservato che il mutante Ile60Asn era meno espresso della sua controparte wild-type, era privo di localizzazione nucleolare e mostrava ridotta capacità di inibizione dell’espressione di ciclina D1; inoltre, la frazione cellulare nelle fasi G2-M risultava aumentata nelle cellule trasfettate con parafibromina mutata. Non sono stati osservati effetti sull’espresione di c-Myc e sull’induzione di apoptosi. In conclusione, la mutazione Ile60Asn sembrava agire secondo un meccanismo di dominanza negativa, e non dare origina solamente ad una forma inattiva di parafibromina. La localizzazione nucleolare di parafibromina è verosimilmente cruciale per perrmettere alla proteina di esercitare le sue funzioni antiproliferative. Questi risultati indicano che i fibromi ossificanti mandibolari che insorgono in pazienti con HPT-JT non rappresentano effetti secondari dell’iperparatiroidismo, ma si presentano in seguito ad un secondo evento mutazionale a carico di CDC73. Le mutazioni di CDC73 non sono responsabili solamente dell’insorgenza di forme familiari di iperparatiroidismo primitivo: mutazioni inattivanti di questo gene, infatti, vengono identificate nel 77% circa dei tumori paratiroidei sporadici maligni. Un’elevata percentuale di carcinomi sporadici con anomalie a carico di CDC73 mostra una forte perdita di immunoreattività per parafibromina. Al contrario, negli adenomi paratiroidei sporadici, CDC73 non sembra avere un ruolo patogenetico di primo piano, dato che risulta mutato molto raramente (0-4%) nei tumori benigni. Tuttavia, secondo nostre precedenti esperienze, l’immunoreattività per parafibromina mostra elevata variabilità, senza differenze significative tra tumori paratiroidei sporadici benigni e maligni. Inoltre, sono stati osservati alcuni casi di adenoma paratiroideo sporadico privi di mutazioni di CDC73, ma con basso livello di espressione di parafibromina. E’quindi possibile ipotizzare l’esistenza di meccanismi, differenti dalla mutazione di CDC73, che possano causare una diminuzione dell’espressione di parafibromina: tra questi, una down-regolazione ad opera di microRNA (miRNA). Attualmente, in letteratura sono presenti solamente due studi sul profilo di espressione di miRNA nei tumori paratiroidei sporadici. Nel presente studio, è stato attuato un approccio di profiling con miRNA-microarrays in 8 adenomi e 3 carcinomi paratiroidei sporadici, per identificare miRNA differenzialmente espressi tra le due condizioni. L’analisi SAM non ha evidenziato miRNA significativamente differenti tra tumori benigni e maligni, mentre la Gene Set Enrichment Analysis su miRNA associati a determinate pathways cellulari ha identificato un arricchimento nei miRNA collegati alle pathways di PKC e PTEN negli adenomi, ed alla pathway di SHH nei carcinomi. E’stato scelto per ulteriori approfondimenti sperimentali miR-9, collegato ad entrambe le vie PKC e PTEN, che ha fra i suoi target predetti in silico CDC73. Il saggio dell’attività luciferasica e il western blot in cellule HEK293A hanno dimostrato che miR-9 era in grado di diminuire l’espressione di parafibromina. Inoltre, era presente un effetto indiretto sull’espressione di ciclina D1, più espressa in cellule trasfettate con miR-9. In sezioni incluse in paraffina dei tessuti tumorali impiegati per l’analisi con mirNA-microarrays, non sono state osservate correlazioni tra il livello di miR-9 e l’immunoreattività per parafibromina e ciclina D1. In conclusione, nei tumori paratiroidei sporadici non è stata evidenziata la presenza di miRNA differenzialmente espressi tra adenomi e carcinomi. MiR-9 ha CDC73 come target in vitro, ma in vivo non sembra essere responsabile delle differnze di immunoreattività per parafibromina e ciclina D1