Interazione tra TPO e suo recettore cMPL in diversi disordini piastrinici

ABSTRACT INTRODUCTION: Megakaryopoiesis is regulated by a complex network of cytokines and chemokines controlling all different stages of the process. Thrombopoietin (TPO), produced constitutively by, the liver, is the main regulator of platelet count and critically influences megakaryocyte proliferation and differentiation through a complex signal transduction TPO levels inversely correlated to platelet count and MK bone marrow mass. cMPL is TPO receptor and it is made up of an intra- and an extracellular domain. Three isoforms, P, K and Tr, were identified and subsequent findings suggested Pisoform being the dominant form Upon ligand-induced Mpl homodimerization, the major signaling events for proliferation are mediated through the JAK-STAT pathway we want to evaluate TPO levels and cMPL expression in different platelet disease, in splectomized subjects and in patients treated with TPO-mimetic. MATERIALS and METHODS: we assessed patients affected by primary immune thrombocytopenia, familial thrombocytopenia, hypoplasia forms and myelodysplastic syndromes. We compared these groups with not affected as well as thrombocythemia patients. The method for measurement for TPO was an ELISA; cMPL was evaluated through cytofluorimetry and Western Blot. RESULTS: cytofluorimetry was not applied to cMPL because of high interassay volatility. The highest TPO levels were found in patients affected by bone marrow hypoplasia; ITP shows TPO levels higher than not affected, essential thrombocythemia and familial thrombocytopenia patients. ITP patients display a higher cMPL than controls and ET, but comparable levels to that of bone marrow hypoplasia. 8 In splenectomized ITP patients TPO and cMPL decreased after splenectomy whereas in TPO-mimetic treated ones they stayed stable. DISCUSSION: according to literature, our ITP patients show a little increase in TPO. Bone marrow hypoplastic as well as myelodisplastic patients display higher cMPL and TPO levels. In ITP there seems to be a linear correlation between TPO and cMPL, whereas in MDS the correlation seems to be indirect. It could be suggested a modulatory role for different receptor isoforms. No clear conclusion can stem from these data due to the reduced dimension of splenectomized and TPO-mimetic treated groups of patients.

RIASSUNTO INTRODUZIONE: la trombopoiesi è un processo multifattoriale dipendente da vari fattori tra cui microambiente midollare, cellule di superficie e fattori di crescita ematopoietici. Il principale fattore che regola la produzione piastrinica è la trombopoietina (TPO), una proteina di 332 aminoacidi, con peso molecolare pari a 95 kDa, contenente due domini: quello amino-terminale con omologia strutturale con l’eritropoietina e quello carbossi-terminale coinvolto nel mantenimento della stabilità della TPO. La TPO è sintetizzata prevalentemente a livello epatico e presenta livelli inversamente correlati al numero di piastrine e alla massa megacariocitaria anche se vi sono delle eccezioni quali i casi di massiva distruzione piastrinica o di trombocitosi reattiva. La TPO aumenta dimensioni e numero dei megacariociti, favorisce l’espressione dei marcatori di superficie per le piastrine (CD41 e CD61) e stimola poliploidia dei megacariociti. Il recettore per la TPO è il cMPL, costituito da un dominio extracellulare e da uno intracellulare, espresso soprattutto a livello di cellule CD34, megacariociti e piastrine. Esistono diverse isoforme del cMPL, K, P e Tr, di cui quella fondamentale per la trasduzione del segnale è la P. Il legame della TPO al suo recettore determina l’omodimerizzazione del recettore con conseguente fosforilazione di JAK2 e attivazione della via di trasduzione del segnale. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare i livelli di TPO e l’espressione di cMPL in diversi disordini piastrinici, in soggetti splenectomizzati e in quelli in terapia con agonista del TPO-R 6 MATERIALI e METODI: le patologie da noi considerate sono state piastrinopenia immune primaria, piastrinopenia costituzionale, forme di ipoplasia midollare e sindromi mielodisplastiche; come gruppo di controllo sono stati considerati soggetti sani e soggetti con trombocitemia essenziale. La TPO è stata dosata con metodica ELISA, il cMPL è stato valutato sia in citofluorimetria sia con Western Blot. La valutazione statistica è stata effettuata con il software GraphPad Prism. RISULTATI: lo studio del cMPL in citofluorimetria non è stato possibile per l’impossibilità a confrontare i risultati ottenuti data l’ampia variabilità interassay. I soggetti con ipoplasia midollare presentano i più alti livelli di TPO dell’intera casistica; nei soggetti con ITP si hanno livelli di TPO superiori ai soggetti sani, alle ET e alle forme familiari e inferiori ai soggetti con ipoplasia midollare. I soggetti con ITP hanno un’espressione di cMPL superiore ai controlli e alle ET, ma del tutto sovrapponibile alle ipoplasie midollari. Nei soggetti splenectomizzati i livelli di TPO e l’espressione del cMPL si è ridotta mentre non vi sono state modifiche nei soggetti trattati con agonista del TPO-R. DISCUSSIONE: analogamente a quanto descritto in letteratura anche nei nostri soggetti con ITP, la TPO è solo modestamente aumentata. I soggetti con ipoplasia midollare, così come quelli con mielodisplasia hanno un’aumentata espressione di cMPL e un aumento dei livelli di TPO. La correlazione tra TPO e cMPL nelle ITP è risultata lineare mentre nelle MDS vi è una correlazione inversa a sottolineare un possibile ruolo modulatorio da parte delle diverse isoforme del recettore. I dati relativi ai soggetti trattati, chirurgicamente o no, sono sovrapponibili a quelli descritti in letteratura ma sono relativi a un gruppo estremamente piccolo di pazienti