Macrophages and neutrophils as major source of B-cells activating factors in H. pylori associated diseases

The cytokine APRIL (A proliferation inducing ligand) and the cytokine BLyS (B lymphocyte simulator) are two recently discovered factors that belong to the TNF-(tumor necrosis factor) family. Since their discovery, these cytokines have been intensively studied for their role in B cells biology. Indeed, APRIL and BLyS are involved in the maturation of B cells, but, most importantly, they increase the survival and proliferation of these cells. However, the effect of these cytokines is amplified in neoplastic B cells in lymphomas, and self-reactive B cells in autoimmune diseases. In particular, it has been demonstrated that APRIL is over-expressed in different types of lymphoma, whereas BLyS is very abundant in serum and tissues of patients with different types of autoimmune diseases, such as, rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematous. In our study, we evaluated the role of these cytokines in two diseases caused by the bacterium Helicobacter pylori (H. pylori): MALT lymphoma (I) and autoimmune gastritis (AIG) (II). (I) the development of lymphoid follicles with germinal centers and an acquired MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) are characteristic of H. pylori-induced gastritis. These MALT represents a pre-neoplastic condition associated with infection, which can evolve into a B-cell lymphoma. It is currently unclear which cytokines or soluble factors promote B cell activation and the genesis of lymphoma during H. pylori infection. In our study, we have demonstrated that gastric MALT lymphoma is characterized by high expression of APRIL. Furthermore, APRIL is over-expressed also in a pre-MALT situation, suggesting that this cytokine may be involved in the induction, as well as in the proliferation of the lymphoma. Further analysis allowed us to identify the macrophages as the main source of APRIL in this type of cancer. We confirmed this observation by in vitro experiments, suggesting that H. pylori is able to induce the secretion of APRIL by macrophages. We have also shown that the contribution to APRIL secretion is supported also by tumour infiltrating T cells specific for H. pylori. Thus, we have demonstrated that H. pylori is able to induce APRIL secretion by macrophage in a direct way, following in vitro infection, but even in an undirect way, mediated by H. pylori-specific T lymphocytes. Our data represent the first evidence of the involvement of APRIL in the development of MALT lymphoma in H. pylori infected patients. Moreover, we identified macrophages as key cells in this process. (II) Among the diseases caused by H. pylori there is also AIG. It has recently been reported that the cytokine BLyS plays a pivotal role in the pathogenesis of two different models of autoimmune disease (collagen induced arthritis and experimental autoimmun encephalomyelitis); in these works, it has been demonstrated that BLyS induce naive T cells to differentiate into the Th17 phenotype. These effector T cells, produce IL-17 and they play a crucial role in the pathogenesis and maintenance of several autoimmune diseases. Thus, given that it is established that H. pylori infection is associated with a Th17 response, we wondered to investigate whether the BLyS/Th17 axis is involved in the development of AIG following H. pylori-infection. To test this hypothesis, we have considered H. pylori-induced chronic gastritis as a model for our analysis because it is the typical inflammatory context that might evolve AIG in susceptible patients. We have demonstrated that patients with chronic gastritis not only present, as expected, a Th17-enriched cellular infiltrate in gastric mucosa, but also that in these biopses there is a significant expression of BLyS. Noteworthy, after the eradication of the bacterium there is a marked reduction of both BLyS and IL-17 cytokines in gastric mucosa, underlining the crucial role of H. pylori in the axis BLyS/Th17. We have also shown that BLyS is able to activate in vitro monocytes and macrophages, inducing the secretion of IL-1β, IL-6, TGF-β and IL-23 by these cells: all these cytokines are fundamental for Th17 cells differentiation. In addition, we identified neutrophils as a possible source of BLyS in gastric mucosa. Indeed, H. pylori-stimulated neutrophils secrete a great amount of BLyS in vitro. Accordingly, there are evidence that neutrophils represent a great percentage of cellular infiltrate during H. pylori-sustained inflammation. Therefore, we hypothesized a model for AIG development of following H. pylori-infection: the bacterium stimulates gastric mucosa-infiltrating neutrophils to release BLyS. BLyS, in turn could on one hand lead to the survival of autoreactive B cells (characterized by auto-antibodies production), but on the other hand, it might also acts on monocytes/macrophages (which are also abundant in the inflammatory infiltrate) for the induction of pro-Th17 cytokines. The Th17-pro-inflammatory profile may increase inflammation and worsen the tissue damage which is typically found in patients with AIG. However, this study is still in progress and many things remain to be understood to validate this model. We first of all need to identify BLyS-expressing cells in chronic gastritis; to this aim different double-immunohistochemistry staining with specific markers for different immune cell types are currently underway. In addition, the results of immunohistochemical analysis will be corroborated with in vitro experiments aimed to: i) confirm the ability of cells, identified by immunohistochemistry, to secrete BLyS following stimulation with H. pylori, ii) confirm the role of BLyS in the differentiation of Th17 cells. Although this second study is currently ongoing, we have demonstrated that H. pylori might create a cytokine microenvironment which can drive the development of MALT lymphoma or AIG. In particular, we have shown that H. pylori is able to induce the production and release of BLyS and APRIL by macrophages and neutrophils, respectively, in two diseases characterized by dysfunction of B cells. These data may suggest that targeting these cytokines may be a new additional therapeutic approach for the treatment of AIG and MALT lymphoma

La citochina APRIL (A proliferation inducing ligand) e la citochina BLyS (B lymphocyte simulator) sono due fattori, scoperti recentemente, facenti parte della famiglia dei TNF (tumour necrosis factor). Dalla loro scoperta entrambe queste citochine sono state intensivamente studiate per il loro ruolo nello sviluppo dei linfociti B. Infatti sia APRIL che BLyS sono coinvolte nella maturazione delle cellule B, ma è stato anche dimostrato che ne aumentano la sopravvivenza e la proliferazione. L’effetto di queste citochine risulta però amplificato su cellule B neoplastiche, che caratterizzano i linfomi, e sulle cellule B auto-reattive, che giocano un ruolo cruciale nelle patologie autoimmuni. In particolare, è stato dimostrato che APRIL risulta sovraespressa specificamente in diversi tipi di linfoma, mentre BLyS è molto abbondante nel siero e nei tessuti di pazienti affetti da diversi tipi di patologie autoimmuni, come ad esempio, l’artrite reumatoide, o il lupus eritematoso sistemico. Nel nostro studio abbiamo valutato il ruolo di queste citochine in due patologie causate dal batterio Helicobacter pylori (H. pylori): i linfomi tipo MALT (I) e la gastrite autoimmune (II). (I) L’infiammazione causata da H. pylori è caratterizzata da una massiva infiltrazione di cellule, che però non riescono ad contrastare efficacemente la crescita batterica. Questo porta molto facilmente alla cronicizzazione dell’infezione che porta allo sviluppo di follicoli linfatici con centri germinativi. Questo follicoli costituiscono una sorta di organo linfoide associato alla mucosa gastrica detto MALT (tessuto linfatico mucosa-associato). L’acquisizione del MALT rappresenta una condizione pre-neoplastica associata all’infezione da H. pylori, che può evolvere verso un linfoma a cellule B. Attualmente non è noto quali citochine o fattori solubili promuovano l’attivazione delle cellule B e la genesi del linfoma a seguito dell’infezione da H. pylori. Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che nel linfoma gastrico di tipo MALT sono espressi alti livelli di APRIL. Inoltre, APRIL risulta sovraepresso anche in una situazione pre-MALT, suggerendo che questa citochina possa essere coinvolta anche nell’induzione, oltre che nel mantenimento del linfoma. Un’analisi approfondita ci ha in seguito permesso di identificare la popolazione macrofagica come fonte principale di APRIL in questo tipo di tumore. Abbiamo poi confermato con esperimenti in vitro che H. pylori è in grado di indurre la secrezione di APRIL da parte dei macrofagi. Abbiamo infine dimostrato che anche le cellule T, specifiche per H. pylori, possono indurre i macrofagi a secernere APRIL. I nostri dati rappresentano la prima evidenza di un coinvolgimento della citochina APRIL nello sviluppo del linfoma MALT in pazienti con infezione da H. pylori e identificano nei macrofagi le cellule chiave nel processo. (II) Tra le malattie che conseguono all’infezione da H. pylori c’è la gastrite autoimmune. E’ stato recentemente dimostrato il ruolo determinante della citochina BLyS in due differenti modelli di malattia autoimmune; BLyS infatti indurrebbe i linfociti T naive a differenziare verso il fenotipo Th17. Queste cellule T effettrici, producono IL-17 e giocano un ruolo cruciale nella genesi e nel mantenimento di numerose patologie autoimmuni. Con queste premesse, abbiamo voluto verificare se nella gastrite autoimmune da H. pylori fosse coinvolto l’asse BLyS/Th17, anche alla luce del fatto che era già noto che l’infezione da H. pylori si associa ad una risposta Th17. Per valutare questa possibilità abbiamo utilizzato come modello di studio la gastrite cronica indotta da H. pylori, in quanto essa può costituire il contesto da cui evolve la gastrite autoimmune. Abbiamo dimostrato che pazienti con gastrite cronica non solo presentano, come atteso, una mucosa riccamente infiltrata di linfociti Th17, ma quest’ultima è anche caratterizzata da una significativa espressione della citochina BLyS. Degno di nota il fatto che l’eradicazione del batterio si accompagna ad una riduzione di entrambe le citochine, BLyS e IL-17, nella mucosa dei pazienti, a sottolineare il ruolo determinante del batterio nel sostenere l’asse BLyS/Th17. Inoltre, abbiamo dimostrato che BLyS è in grado attivare in vitro monociti e macrofagi e di indurre la secrezione da parte di queste cellule di IL-1β, IL-6, TGF-β and Il23, tutte citochine coinvolte nel differenziamento delle cellule Th17. In aggiunta abbiamo identificato i neutrofili come potenziale fonte di BLyS nella mucosa gastrica. Infatti, neutrofili stimolati in vitro con H. pylori secernono grandi quantitativi di BLyS ed inoltre sono dimostrati essere la maggior componente dell’infiltrato cellulare nell’infezione di H. pylori. Quindi, abbiamo ipotizzato un modello di sviluppo della gastrite autoimmune a seguito dell’infezione di H. pylori: il batterio stimolerebbe i neutrofili infiltranti la mucosa gastrtica a rilasciare BLyS. BLyS, potrebbe da un lato indurre la sopravvivenza delle cellule B autoreattive (con relativa produzione di auto-anticorpi), ma anche agire sui monociti/macrofagi (anch’essi abbondanti nell’infilatrato infiammatorio) inducendo la secrezione di citochine che portano al differenziamento delle cellule Th17. Il profilo pro-infiammatorio delle cellule Th17, potrebbe aumentare l’infiammazione e peggiorare il danno tissutale tipicamente riscontrato nei pazienti con gastrite autoimmune. Tuttavia, questo studio è tuttora in corso d’opera e molte cose restano da capire per validare questo modello. Bisogna innanzitutto identificare le cellule esprimenti BLyS nella gastrite cronica; a questo scopo,diverse prove di co-immunoistochimica con marcatori specifici per i diversi tipi di cellule del sistema immunitario sono attualmente in corso. Inoltre, i risultati delle immunoistochimiche saranno corroborati con esperimenti in vitro mirati a: i) confermare la capacità delle cellule, identificate per immunoistochimica, di secernere BLyS a seguito di stimolazione con H. pylori; ii) confermare il ruolo di BLyS nel differenziamento delle cellule Th17. Ancorché questo secondo studio sia attualmente in corso, riteniamo plausibile proporre l’idea generale che H. pylori possa creare un microambiente citochinico favorevole allo sviluppo sia del linfoma tipo MALT che della gastrite autoimmune. In particolare, abbiamo dimostrato che questo batterio è in grado di indurre la produzione ed il rilascio di APRIL e BLyS da parte di macrofagi e neutrofili rispettivamente, in due patologie caratterizzate da una disfunzione delle cellule B. Questi dati potrebbero suggerire che terapie mirate verso queste citochine potrebbero diventare un nuovo approccio terapeutico per la cura del MALT linfoma e della gastrite autoimmune