Analysis of the molecular mechanisms of the antineoplastic effect of ouabain

Ouabain is a cardiac glycoside whose primary action is inhibition of Na/K ATPase activity, a ubiquitous enzyme responsible for translocating Na and K ions across the cell membrane using ATP as the driving force. It has been demonstrated that the Na/K ATPase also functions as a classical receptor, capable of converting cardiac glycodise binding into activation of various protein kinase cascades (Liu and Xie, 2010). Also, recent studies have shown that cardiac glycosides selectively inhibit cell proliferation and/or induce apoptosis in several cancer cell lines (Schoner and Sheiner-Bobis, 2007). These in vitro studies are supported by epidemiological data reporting a protection from several types of cancer in patients who were on cardiac glycoside treatment (Stenkvist, 1999; Haux 1999; Haux et al, 2001). To elucidate the cellular and molecular mechanisms underlying cardiac glycoside effect against cancer cells, we studied the effect of ouabain (1-100 nM) on two cancer cell lines, Jurkat (human T cell lymphoblast-like cell line) and A549 (human lung adenocarcinoma epithelial cell line). Ouabain (1-20 nM) induced a concentration-dependent decrease in proliferation of both cell lines. At higher concentrations (50-100 nM) ouabain was cytotoxic for the two cancer cell lines, as demonstrated by the increase in Annexin V/propidium iodide binding. At the same concentrations, ouabain did not affect cell viability of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and, as previously shown in our laboratory, protected from apoptosis human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Trevisi L et al., 2004). Ouabain increased Src and ERK1/2 phosphorylation in A549 and Jurkat thus demonstrating the activation of the known signaling pathways triggered by Na/K ATPase signalosome. However, pharmacological inhibition of Src or MEK did not abolish the cytotoxic activity of ouabain. In both cell lines ouabain caused a decrease of phospho-Akt levels. Decrease of Bcl-2 protein levels and mitochondrial membrane potential were early events of ouabain treatment in both cell lines. However, only in Jurkat cells were observed caspase 3/7 activation, DNA ladder fragmentation and inhibition of cell death by the pan caspase inhibitor Z-VAD-fmk, hallmarks of caspase-dependent apoptosis. On the other hand, a marker of autophagy, i.e. conversion of LC3-I to LC3-II isoform, was observed in ouabain-treated A549. Moreover, ouabain enhanced the autophagic flux in A549 as demonstrated by increase of p62 degradation and increase of punctate pattern of LC3 after co-incubation with chloroquine, a drug that blocks fusion of autophagosomes with lysosomes. Furthermore, cell death induced by ouabain was completely blocked by treatment with an inhibitor of autophagy such as 3-methyladenine. It has been suggested that decrease of Bcl-2 levels could induce autophagy since Bcl-2 interacts with the autophagic protein Beclin 1, inhibiting the formation of the autophagy initiation complex (Pattingre S et al., 2005). This interaction is regulated by JNK because JNK-dependent phosphorylation of Bcl-2 causes Bcl-2 degradation and disruption of Bcl-2/Beclin1 complex. In A549 treated with ouabain the levels of Beclin 1 were manteined costant. However, inhibition of JNK with SP600125 blocked cell death induced by ouabain only in A549. We speculate that JNK activation by ouabain in A549 reduces Bcl-2 levels thus releasing Beclin 1 and inducing autophagy. Further studies will be required to confirm this hypothesis. Finally, to ascertain whether differences in sensitivity to ouabain among normal and cancer cells are related to a specific pattern of Na/K ATPase α subunit isoform expression, western blotting analysis of α isoforms was performed in Jurkat and A549 cells and compared to the expression pattern of two normal cell lines: HUVEC and PBMC. We found that α1 isoform is ubiquitous, α2 isoform is not expressed only in PBMC and that α3 isoform is expressed exclusively in the two cancer cell lines. These data suggest that α3 subunit could be critical for ouabain cytotoxic effect.

L’ouabaina é un glicoside cardioattivo la cui azione più nota è l’inibizione della Na/K ATPasi, enzima ubiquitario della membrana plasmatica responsabile del trasporto di ioni Na e K attraveso le membrane utilizzando ATP come forza motrice. È stato dimostrato che la Na/K ATPasi, oltre alla sua funzione di pompa, é in grado di agire come recettore, attivando varie cascate di segnale (Liu and Xie, 2010). Studi recenti hanno dimostrato che i glicosidi cardioattivi inibiscono in maniera selettiva la proliferazione e/o inducono apoptosi in diverse linee di cellule tumorali (Schoner and Sheiner-Bobis, 2007). Questi studi in vitro sono supportati da dati epidemiologici che evidenziano una protezione da vari tipi di cancro in pazienti trattati con glicosidi cardioattivi (Stenkvist, 1999; Haux 1999; Haux et al, 2001). Al fine di chiarire il meccanismo molecolare e cellulare alla base dell’effetto citotossico dei glicosidi cardioattivi sulle cellule tumorali, abbiamo studiato gli effetti dell’ouabaina (1-100 nM) nei confronti di due linee cellulari tumorali, le Jurkat (una linea proveniente da un linfoma a cellule T) e le A549 (linea ottenuta da carcinoma bronchiolo-alveolare). Il trattamento con ouabaina (1-20 nM) provocava una diminuzione della proliferazione cellulare concentrazione dipendente in entrambe le linee cellulari. Alle concentrazioni più elevate (50-100 nM) l’ouabaina era citotossica per le due linee cellulari testate, come dimostrato dall’aumento di cellule Annessina V/propidio positive. Alle stesse concentrazioni l’ouabaina non alterava la vitalità delle cellule mononucleate estratte da sangue periferico umano (PBMC) e, come già dimostrato nel nostro laboratorio, proteggeva dall’apoptosi le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) (Trevisi L et al., 2004). Il trattamento con ouabaina induceva l’attivazione delle chinasi Src ed ERK1/2 in entrambe le linee cellulari, confermando così la stimolazione della nota cascata di segnale innescata dala Na/K ATPasi. Tuttavia, l’inibizione farmacologica della Src o della MEK non contrastava l’effetto citotossico dell’ouabaina. In entrambe le linee cellulari il trattamento con ouabaina induceva una diminuzione della fosforilazione di Akt. In entrambe le linee cellulari, la diminuzione della proteina antiapoptotica Bcl-2 e del potenziale di membrana mitocondriale costituivano gli eventi iniziali a seguito del trattamento con ouabaina. Tuttavia, solo nelle Jurkat sono stati riscontrati alcune marcatori dell’apoptosi caspasi-dipendente quali l’attivazione delle caspasi 3/7, la tipica frammentazione del DNA (DNA ladder) e l’inibizione della morte cellulare indotta dall’inibitore pan caspasico Z-VAD-fmk. Al contrario nelle A549 sono stati riscontrati i classici marcatori di autofagia come la conversione di LC3 dalla forma LC3-I alla isoforma LC3-II. Inoltre l’ouabaina aumentava il flusso autofagico nelle A549, come dimostrato dall’aumento della degradazione di p62 e dall’aumento delle forme puntate di LC3 in caso di co-incubazione con clorochina, un inibitore della fusione lisosomi-autofagosomi. Infine la morte cellulare indotta da ouabaina era bloccata dal trattamento con l’inibitore dell’autofagia 3-metiladenina. È stato ipotizzato che la diminuzione della Bcl-2 induca autofagia in quanto la Bcl-2 interagisce con Beclin 1 prevenendo così la formazione del complesso di iniziazione (Pattingre S et al., 2005). Tale interazione è regolata da JNK, la quale fosforilando Bcl-2, causa la sua degradazione e la rottura del complesso Bcl-2/Beclin 1. Nelle A549 trattate con ouabaina i livelli di Beclin 1 erano costanti, ma l’inibizione di JNK con SP600125 bloccava la morte cellulare. Noi ipotizziamo che l’attivazione di JNK da parte dell’ouabaina nelle A549 riduca i livelli di Bcl-2 permettendo il rilascio di Beclin 1 e di conseguenza attivi il processo di autofagia. Ulteriori studi saranno necessari per chiarire questo punto. Infine, attraverso l’analisi western blotting è stata studiata l’espressione delle varie isoforme della subunità α della Na/K ATPase nelle due linee tumorali studiate (A549 e Jurkat) e paragonata a quella di due linee normali (HUVEC e PBMC), allo scopo di verificare se le differenze nella sensibilità all’ouabaina fra cellule normali e tumorali possano essere ascritte ad uno specifico tipo di espressione della varie isoforme della subunità α. I nostri risultati indicano che l’isoforma α1 è ubiquitaria, l’isoforma α2 non è espressa solo nei PBMC mentre l’isoforma α3 è espressa solo nelle due linee cellulari tumorali. Questo dato suggerisce che la subunità α3 possa essere determinante per gli effetti citotossici dei glicosidi cardioattivi nei confronti delle cellule tumorali.