Mass Spectrometry-Based Quantitative Proteomics to Study Proteomes, Phosphoproteomes and Interactomes

Over the past few years, mass spectrometry-based proteomics has been widely applied to the most diverse fields of biochemistry, biomedicine and biology, and several approaches have been developed to allow absolute and relative quantification of proteins in very complex mixtures. During my PhD, I have conducted three main studies, taking advantage of different quantitative proteomics techniques. In particular SILAC and iTRAQ approaches have been exploited to investigate the calcification process induced by endotoxin in clonal interstitial aortic valve cells, while SILAC and label-free quantitative approaches have been exploited to identify new potential interacting partners and substrates of the protein kinase CK2. Calcific aortic valve disease represents the most common type of valvular disease and the first cause of surgical valve replacement in the industrialized world. No medical therapies are available to prevent or slow down calcium deposition within the valve leaflets, therefore surgery is the only possible treatment. To investigate the molecular mechanisms underlying the calcification process, SILAC and iTRAQ proteomics approaches have been applied to bovine interstitial aortic valve cells, a cellular model that is able to acquire a pro-calcific profile and drive matrix mineralization upon treatment with an inflammatory stimulus like the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). The application to the same cellular model of two different quantitative technologies, led to the identification and relative quantification of hundreds of proteins, among which many showed a significant alteration in response to LPS. The acquired data suggest that cellular oxidoreductase activity, cytoskeletal and spliceosome regulation, glycolisis/gluconeogenesis, and arginine metabolism are altered during the acquisition of the pro-calcific profile. These results represent a starting point to investigate more in detail the molecular mechanisms that seem to be strongly involved in the calcification process induced by LPS. The other projects described in this thesis focus on CK2, an essential, constitutively active and highly pleiotropic protein kinase. CK2, like many other kinases, is strongly involved in several cellular processes, and in particular it has been hypothesized that this enzyme plays a crucial role in the transduction of survival signals. However, a clear comprehension of the multiple roles played by this kinase within the cell has not been achieved. The aim of these projects was the identification of interacting partners and substrates of CK2 by means of proteomics approaches to try to shed some light on the functions performed by this kinase. In particular a combination of immunoprecipitation experiments and label-free quantitative analyses has been performed to identify new potential interacting partners of CK2, while the SILAC technology, in combination with the use of a specific and potent inhibitor of CK2, was exploited to identify new putative substrates of this kinase directly in a cellular system. The results obtained confirm the notion that CK2 plays a role in many fundamental cellular functions and clearly indicate a strong involvement of this kinase in the biological processes of protein biosynthesis and degradation. Moreover interesting aspects linked to phosphorylation/dephosphorylation turnover rates emerged from these analyses. A detailed discussion, from a technical and biological point of view, of the data collected is presented. Finally, during my PhD I also collaborated to a project aiming at the identification of the primary molecular targets of antimicrobial photodynamic therapy. This work, not discussed in the thesis, has recently been submitted to the “Journal of Proteomics” with the title: “Molecular Targets of Antimicrobial Photodynamic Therapy Identified by a Proteomic Approach”.

Negli ultimi anni, la ricerca proteomica basata sulla spettrometria di massa è stata applicata in modo esponenziale ai più diversi campi della biochimica, biomedicina e biologia, permettendo il parallelo sviluppo di nuovi approcci per la quantificazione relativa e assoluta delle proteine. Nel corso del mio dottorato, ho seguito lo sviluppo di tre progetti principali, sfruttando diverse tecniche di spettrometria quantitativa. In particolare, le tecnologie SILAC e iTRAQ sono state applicate allo studio del processo di calcificazione delle cellule interstiziali delle valvole aortiche, mentre i metodi SILAC e di quantificazione label-free sono stati sfruttati per l’identificazione di potenziali interattori e substrati della protein chinasi CK2. La calcificazione delle valvole aortiche è una delle più comuni patologie valvolari e prima causa di sostituzione valvolare nei paesi industrializzati. A oggi sfortunatamente non esistono terapie che possano prevenire o curare la deposizione di calcio nelle valvole aortiche, e l’unica soluzione è l’intervento chirurgico. Per chiarire le basi molecolari di questo processo, abbiamo applicato le metodiche SILAC e iTRAQ ad un modello cellulare basato su cellule valvolari cardiache bovine (BVIC), in grado di acquisire un profilo pro-calcifico e favorire la mineralizzazione della matrice extra-cellulare in risposta ad uno stimolo infiammatorio come l’endotossina lipopolisaccaride (LPS). L’utilizzo di due diverse tecnologie allo stesso modello cellulare ha permesso l’identificazione, e la relativa quantificazione, di centinaia di proteine, parecchie delle quali mostrano una significativa alterazione in risposta al trattamento con LPS. L’analisi dei dati ha infatti rivelato l’alterazione di proteine appartenenti a diversi processi cellulari, quali la regolazione del citoscheletro, dei meccanismi ossidoriduttivi e dello spliceosoma, la via metabolica della glicolisi/gluconeogenesi, e il metabolismo dell’arginina, suggerendo il coinvolgimento di queste vie nel fenomeno della calcificazione delle valvole aortiche. Questi risultati rappresentano perciò un punto di partenza per nuovi dettagliati studi dei meccanismi molecolari alla base della calcificazione valvolare indotta da LPS. Gli altri progetti descritti in questa tesi sono focalizzato su CK2, una protein chinasi essenziale, altamente pleiotroica e costitutivamente attiva, fortemente implicata in una moltitudine di processi cellulari, in particolare nella trasduzione dei segnali di sopravvivenza, per la quale sembra giocare un ruolo chiave. Tuttavia una completa comprensione del ruolo che CK2 ricopre nei vari processi cellulari in cui è implicata non è ancora stata raggiunta, perciò questo lavoro ha come scopo l’identificazione di nuovi potenziali interattori e substrati di CK2, allo scopo di chiarire maggiormente la sua funzione all’interno della cellula. Nello specifico, abbiamo abbinato esperimenti d’immunoprecipitazione e analisi quantitativa label-free per lo studio delle proteine che interagiscono con CK2, mentre la tecnologia SILAC combinata con l’uso di un inibitore potente e specifico di CK2 è stata applicata alla ricerca di nuovi potenziali substrati di questa chinasi direttamente in un sistema cellulare. I risultati ottenuti confermano le conoscenze già note riguardo al coinvolgimento di CK2 in diversi processi essenziali per la vita cellulare, e fanno emergere chiaramente un coinvolgimento di primo piano di CK2 nei processi di biosintesi e degradazione proteica. Inoltre, l’analisi dei dati ha anche rivelato interessanti ed inattesi aspetti del turnover di fosforilazione/defosforilazione di proteine fosforilate da CK2. I dati ottenuti sono dettagliatamente presentati in questa tesi, da un punto di vista sia tecnico che biologico. Infine, durante il dottorato ho anche collaborato alla realizzazione di un progetto volto all’identificazione di bersagli molecolari nella terapia fotodinamica antimicrobica, utilizzando un approccio proteomico. Da questa collaborazione, è nato un lavoro (non descritto in questa tesi) che è stato recentemente sottoposto a “Journal of Proteomics” con il titolo: “Molecular Targets of Antimicrobial Photodynamic Therapy Identified by a Proteomic Approach”.