Role of microRNAs in T-cell activation and transformation by human T-cell Leukemia virus type 1

Human T-Lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the causative agent of two distinct pathologies, adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), an aggressive malignancy of mature CD4+ T-cells, and tropical spastic paraparesis/HTLV-1-associated myelopathy (TSP/HAM), a demyelinating neurodegenerative disease. Despite intense study, many aspects of HTLV-1 replication, persistence and pathogenesis remain to be understood. The work described in the present thesis was aimed at defining the role of microRNAs (miRNAs) in HTLV-1 infection and ATLL pathogenesis. We generated small RNA libraries from normal CD4+ cells (resting and stimulated) and two T-cell lines chronically infected with HTLV-1 (MT-2 and C91PL). Libraries were analyzed by 454 mass sequencing and data were processed through a series of computational steps to identify known and candidate new miRNAs for each library. Comparison of frequencies of known miRNAs in the different libraries led to the identification of 14 downregulated miRNAs and 4 upregulated species in infected cell lines vs. resting CD4+ cells, while 21 miRNAs were differentially expressed (16 downregulated, 5 upregulated) in stimulated compared to resting CD4+ cells. We validated the expression of some new miRNA candidates identified by bioinformatic analysis of the libraries through end point and quantitative RT-PCR. Two sequences mapped to the HTLV-1 genome, suggesting that the virus may produce its own miRNAs under certain conditions. We examined the profiles of known miRNA expression in ATLL cells and normal resting and activated T CD4+ lymphocytes using microarrays. On the basis of miRNA expression, cluster analysis of ATLL samples and CD4+ controls showed that the resting controls were highly related to each other, while the tumor samples exhibited some heterogeneity. Statistical analysis revealed 6 upregulated and 21 downregulated miRNAs in ATLL cells compared to CD4+ T-cell controls. Several of the differentially expressed miRNAs identified in the libraries and by microarray analysis were validated by real time RT-PCR. Since miRNA-mRNA interactions often result in degradation of the target mRNA, integration of results from target prediction programs with expression profiles for miRNAs and mRNAs can aid in identifying genuine mRNA targets. This approach was applied to miRNA and mRNA microarray data obtained for our ATLL and resting CD4+ samples. Potential targets for 12 miRNAs differentially expressed in ATLL cells were identified by integrating miRNA and mRNA expression profiles. Functional enrichment analysis of predicted targets revealed the presence of several genes belonging to the cAMP signalling pathway, which is known to be activated upon HTLV-1 transformation. We also investigated the role of miR-34a, consistently upregulated in ATLL samples and HTLV-1 infected cells lines. Knockdown of miR-34a in infected cell lines determined an increased in cell death, suggesting that miR-34a could play an important role in the expansion of HTLV-1 infected cells and thereby in ATLL development.

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è l’agente eziologico della leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL, adult T-cell leukemia/lymphoma) e della paraparesi spastica tropicale/mielopatia associata ad HTLV (TSP/HAM, Tropical spastic paraparesis/HTLV-associated myelopathy), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. Recenti evidenze suggeriscono che i microRNA (miRNA) contribuiscano a questo processo di trasformazione mediata da HTLV-1. Le ricerche condotte nel corso del mio dottorato sono state mirate ad approfondire il ruolo dei microRNA (miRNA) nell’infezione di cellule T da parte di HTLV-1 e nella patogenesi dell’ATLL. Sono state realizzate librerie di cDNA di piccoli RNA, a partire da linfociti T CD4+ normali (resting e attivati) e da due linee cellulari cronicamente infettate con HTLV-1 (C91PL e MT-2). Le librerie sono state analizzate attraverso il sequenziamento di massa 454 e l’analisi bioinformatica delle sequenze ottenute ha permesso l’identificazione dei miRNA noti e nuovi miRNA candidati presenti in ciascuna libreria. Il confronto delle frequenze dei miRNA noti nelle diverse librerie ha evidenziato la presenza di 14 e 4 miRNA rispettivamente downregolati e upregolati nelle linee cellulari infettare rispetto ai linofociti T CD4+ resting, mentre 21 miRNA sono risultati differenzialmente espressi in linfociti T CD4+ stimolati in confronto ai linfociti T CD4+ resting (16 downregolati, 5 upregolati). L’espressione di diversi nuovi miRNA, individuati dall’analisi bioinformatica delle librerie, è stata validata attraverso RT-PCR end-point o RT-PCR quantitativa. Inoltre la nostra analisi ha rivelato nelle librerie da cellule infettate 2 sequenze che mappano in regioni trascritte del genoma di HTLV-1 e che potrebbero rappresentare dei miRNA virali. Attraverso l’impiego di microarray il profilo di espressione dei miRNA noti è stato analizzato in pazienti ATLL e in linfociti T CD4+ resting e stimolati. In base ai profili di espressione di miRNA ottenuti i campioni sono stati raggruppati in cluster che indicano una forte similitudine all’interno dei campioni di linfocititi T CD4+ resting, mentre i campioni di ATLL hanno profili di espressione di miRNA più eterogenei. L’analisi statistica ha evidenziato 21 miRNA downregolati e 6 upregolati nei pazienti ATLL vs linfociti T CD4+ resting. Diversi miRNA differenzialmente espressi identificati attraverso l’analisi delle librerie e dei microarray sono stati validati tramite RT-PCR quantitativa. Dal momento che l’interazione miRNA-mRNA spesso comporta la degradazione del messaggero bersaglio, l’analisi integrata dei risultati dei programmi di predizione di bersagli con i profili di espressione di miRNA e geni può aiutare nell’identificazione di target. Abbiamo applicato questo approccio ai dati di espressione di miRNA e geni ottenuti per i nostri campioni di ATLL e linfociti T CD4+ resting. Dall’integrazione dei profili di espressione di miRNA e mRNA sono stati identificati i target putativi per 12 miRNA differenzialmente espressi nei pazienti ATLL. L’arricchimento funzionale dei geni bersaglio predetti ha evidenziato la presenza di diversi geni coinvolti nella via di segnale di cAMP, noto per essere presente ad alti livelli in cellule trasformate da HTLV-1. Infine abbiamo indagato il significato funzionale di miR-34a, che risulta essere consistentemente upregolato in pazienti ATLL e linee cellulari infettate. Il silenziamento di miR-34a in linee cellulari infettate determina un aumento della morte cellulare, suggerendo che la deregolazione di questo miRNA possa svolgere un ruolo importante nell’espansione della popolazione di cellule infettate da HTLV-1 e quindi nello sviluppo dell’ATLL.