Biodiesel from microalgae: the link between photosynthesis and productivity in Nannochloropsis gaditana

SUMMARY Most biodiesel is currently produced from oleaginous crops like sunflower or soybean. However, the use of crop plants for this kind of applications presents many limitations. One is that even in the most producing species oils are less than 5% of total biomass basis, thus limiting the possible productivity. On the contrary, in some species of microalgae more that 50% of the total dry matter is represented by lipids. Algae have thus a promising potential as feedstock for biodiesel production. However, a strong research effort is still needed to fulfill their potential in large scale production to at least partially replace fossil fuels. Species belonging to the genus Nannochloropsis are considered among the most promising for biodiesel production because of their ability to accumulate large amounts of lipids. The general aim of this work was to analyze the role of photochemical efficiency in the productivity of the marine microalga Nannochloropsis gaditana. The efficiency in using light is in fact fundamental to have productive large scale algae cultivation. As for all photosynthetic organisms, light is a major factor influencing algae growth since it provides all the energy supporting metabolism. However, radiation can also be dangerous because, if in excess, it may drive the formation of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress affecting algae productivity. In the second chapter the effect of different light regimes on biomass and lipids productivity of Nannochloropsis gaditana is assessed. Results showed that this organism is able to adapt to a wide range of light intensities by activating an acclimative response and maintain growth rate. The exposition to different light intensities did not show differences in lipids accumulation. In the third chapter similar experiments were performed in the presence of excess CO2, one major factor for algae large scale cultivation. Algae are in fact able to exploit CO2 externally provided to support and increase the biomass productivity. Here, the combined effect of light intensity and carbon dioxide on Nannochloropsis gaditana growth and lipids productivity was analyzed. Results showed that excess CO2 strongly increased the growth rate at all light intensities and that under strong illumination lipids synthesis was stimulated. Thus, strong illumination does not induce lipids accumulation per se but it contributes when excess CO2 is also present. A major signal inducing lipids accumulation in algae is nutrients limitation and nitrogen starvation in particular. In these conditions, Nannochloropsis cells can accumulate up to 70% of dry weight as lipids. In the fourth chapter, the influence of this macronutrient availability on photosynthetic efficiency in Nannochloropsis cells was assessed. Results showed that nitrogen depletion affects the whole photosynthetic chain with Photosystem II (PSII) particularly affected. As a result linear electron flow from PSII to PSI is strongly decreased. Nannochloropsis cells were still able to maintain a residual photosynthetic efficiency exploiting alternative electron flow such as cyclic electron transport around PSI. In conclusion this work showed that Nannochloropsis could be considered a good candidate for the outdoor biodiesel production because of its good growth rate, its lipids accumulation and its ability to adapt to very different illumination intensities that usually characterize the natural environment. However, strong nutrient stress treatments, although effective in inducing large relative lipids content, limit the overall process productivity because of a reduced photosynthetic efficiency and are thus not suitable in a perspective of a large scale production. Finally, the observation that cells are able to adapt their photosynthetic apparatus to respond to this type of stress opens the possibility of finding optimized conditions where a nutrient limitation can stimulate the lipids accumulation without affecting photosynthetic efficiency or improve responses to nutrient depletion by genetic engineering Nannochloropsis cells. In the fifth chapter nitrogen depletion effects on photosynthetic apparatus were compared with that in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii, showing even in this case the alteration of the balance between the two photosystems in response to N availability. PSII was confirmed as the major target under N deprivation with the linear electron flow from PSII to PSI showing a decreased amount. However, under nitrogen deprivation the cyclic electron flow was strongly exploited. Concluding, the re-organization of the entire photosynthetic apparatus and the improvement of alternative electron flows instead of LEF in both Nannochloropsis and Chlamydomonas seem to be a common response to nitrogen deficiency in algae even not strictly correlated from an evolutive point of view. In appendix 1 the influence of different light intensities was tested using alternation of light and dark cycles with different frequencies, which mimic illumination variations in a photobioreactor due to mixing. Results showed that Nannochloropsis is able to use efficiently very intense light in presence of the optimal frequency of light-dark cycles. In fact, when the frequency was not optimal Nannochloropsis suffered a reduced photosynthetic productivity and remarkable photodamages. Thus, the mixing optimization has to be considered a seminal parameter for algae to exploit light energy with the highest efficiency. In order to understand as much as possible the basic mechanisms for light adaptation, a part of this work was then focused on the biochemical characterization of a protein involved in the regulation mechanism of photosynthesis, the Violaxanthin De-Epoxidase (VDE). In particular, it participates to the xanthophylls cycle, a well known photoprotection mechanism and it is known that at neutral pH, VDE is soluble in the lumen but it binds to the thylakoids upon a conformational change when the pH decreases. In appendix 2, for convenience the VDE belonging to the model higher plant Arabidopsis thaliana was studied. In any case, recently, a homologue gene for this protein was found in Nannochloropsis. The pH-dependent activation mechanism of this enzyme was analyzed and thanks to an in silico analysis we were able to identify the residues which are putatively involved in the pH dependent conformational change. We also mutated these residues to verify experimentally if they were indeed important for the enzyme activity and results indicated that each identified key residue was sufficient to induce the first step of the activation and all the residues together produced a cooperative effect on the final activity.

RIASSUNTO Attualmente il biodiesel è prodotto da piante superiori quali girasole e soia definite oleaginose per la loro capacità di accumulare lipidi nei semi. Tuttavia, il loro impiego per la produzione di oli combustibili presenta numerose limitazioni. Ad esempio, nel caso delle specie di piante maggiormente produttive meno del 5% sulla biomassa totale è rappresentato da lipidi. In alcune specie di microalghe, invece, più del 50% del peso secco è stimato essere in lipidi rendendo tali organismi decisamente competitivi nella possibile produzione di biodiesel. Tuttavia, è necessario ampliare le ricerche nel campo in modo tale da riuscire a sfruttare appieno il potenziale insito nelle alghe per una produzione su larga scala. In questo senso, le specie appartenenti al genere Nannochloropsis riscuotono un grande successo, dovuto principalmente alle caratteristiche fondamentali che caratterizzano questo genere, ovvero una buona velocità di crescita accompagnata da una buona produzione in termini di lipidi. Questo lavoro si propone di analizzare il ruolo svolto dalla fotosintesi nella produttività finale di una microalga marina, Nannochloropsis gaditana. L’efficienza nell’utilizzo della luce è infatti un punto cardine per massimizzare la produttività algale su larga scala. In tutti gli organismi fotosintetici la luce è uno dei fattori che maggiormente ne influenza la crescita dal momento che è essenziale per tutti i processi metabolici. Tuttavia, la radiazione luminosa può in alcuni casi essere fonte di stress. Per esempio, quando la luce incidente sull’organismo è in eccesso può portare alla formazione di forme reattive dell’ossigeno e a stress ossidativi che in qualche modo vanno ad agire sulla produttività delle alghe. Nel secondo capitolo, colture di Nannochloropsis gaditana sono state esposte a diverse intensità luminose e per ciascuna di esse sono stati monitorati il tasso di crescita e la produttività in termini di lipidi. I risultati raccolti hanno dimostrato come Nannochloropsis sia in grado di adattarsi a tutte le intensità luminose testate attivando una risposta acclimativa che ne ha permesso la crescita nelle diverse condizioni. Tuttavia l’intensità luminosa non sembra avere un effetto particolare sulla produzione finale di lipidi. Nel terzo capitolo, colture di Nannochloropsis sono state esposte alle stesse intensità luminose del capitolo precedente ma in presenza di un flusso di aria miscelato con anidride carbonica al 5% in quanto questo ultimo componente rappresenta uno dei maggiori fattori utilizzati nella produzione di biodiesel su larga scala. Le alghe infatti sono in grado di sfruttare in modo molto efficiente la CO2, utilizzandola per incrementare il tasso di crescita. In questo capitolo è stato analizzato l’effetto combinato di luce ed eccesso di CO2 sulla crescita e sulla produttività lipidica di Nannochloropsis. I risultati ottenuti hanno dimostrato come l’eccesso di CO2 stimoli positivamente la crescita algale, aumentando la quantità di biomassa finale e allo stesso modo la sintesi di lipidi, che in eccesso di luce è fortemente incrementata. La limitata disponibilità di nutrienti è uno dei maggiori fattori che influenza la sintesi di lipidi nelle alghe, in particolare la mancanza di azoto. In queste condizioni, Nannochloropsis è in grado di accumulare lipidi fino al 70% rispetto al peso secco. Nel capitolo quattro è stata quindi studiata l’influenza della carenza di azoto in colture di Nannochloropsis. I risultati prodotti hanno stabilito come in carenza di azoto si instauri una riorganizzazione dell’intero apparato fotosintetico confermando il PSII come il maggior target di tale stress producendo, inoltre, come conseguenza una diminuzione del trasporto elettronico lineare dal PSII al PSI e un forte aumento del trasporto ciclico intorno al PSI. Nannochloropsis, dunque, si presenta come candidato ideale per la produzione di biodiesel grazie al veloce tasso di crescita, alla buona produzione lipidica e all’estremo grado di adattamento alle più diverse intensità luminose che normalmente caratterizzano l’ambiente naturale. Tuttavia, l’utilizzo della forte carenza di azoto per la stimolazione dell’accumulo di lipidi non sembra il metodo migliore per la produzione di biodiesel su larga scala in quanto l’efficienza fotosintetica delle alghe ne è fortemente risentita con una riduzione della produttività finale. Ad ogni modo, il fatto che Nannochloropsis sia in grado di modulare il proprio apparato fotosintetico in risposta a cambiamenti ambientali implica la possibilità di trovare un equilibrio tra il grado di stress applicato alle alghe e il mantenimento di una buona efficienza fotosintetica nonché di modificare geneticamente le alghe in modo tale da aumentare la sintesi di lipidi finale. Nel capitolo cinque gli effetti della carenza di azoto sono stati studiati nell’alga verde Chlamydomonas reinhardtii, verificando anche in questo caso come la disponibilità di azoto influenzi soprattutto il PSII e il trasporto ciclico degli elettroni risulti incrementato in carenza di azoto. Comparando le risposte di Nannochloropsis e Chlamydomonas si può quindi proporre la riorganizzazione dell’intero apparato fotosintetico e lo sfruttamento di flussi alternativi di elettroni rispetto al comune lineare, come una tipica risposta adattiva alla mancanza di azoto nelle alghe. Nell’appendice 1 l’influenza delle diverse intensità luminose è stata analizzata applicando alle alghe un’alternanza di cicli luce-buio a diverse frequenze che potessero simulare le condizioni di ombreggiamento dovute al mescolamento presenti in un fotobioreattore. I risultati proposti hanno dimostrato come Nannochloropsis sia in grado di sfruttare al meglio anche le intensità luminose molto elevate purché la frequenza dei cicli luce-buio sia ottimale. In caso contrario le cellule sono sottoposte ad una drastica riduzione nell’efficienza fotosintetica con conseguente calo della produttività. L’ottimizzazione del mescolamento, dunque, è da considerarsi come un parametro fondamentale per poter sfruttare pienamente la capacità di utilizzo della luce da parte delle alghe. Per poter capire nel modo più dettagliato possibile i meccanismi di base che permettono agli organismi fotosintetici di adattarsi alle variazioni di intensità luminosa, una parte di questo lavoro è stata incentrata sullo studio di una proteina coinvolta in un ben noto meccanismo di fotoprotezione, il ciclo delle xantofille. L’enzima preso in considerazione è la Violaxantina De-Epossidasi (VDE) che a pH neutri si trova solubile nel lumen tilacoidale per poi essere in grado di legarsi ai tilacoidi una volta che il pH acidifica, assumendo un cambiamento conformazionale. Nell’appendice 2 è trattata la VDE della pianta superiore Arabidopsis thaliana, organismo scelto per comodità sperimentale, anche se recentemente un gene omologo che codifica per la VDE è stato trovato anche in Nannochloropsis. Il meccanismo pH-dipendente è stato indagato grazie ad analisi in silico che hanno permesso di riconoscere i residui aminoacidici coinvolti nel cambiamento conformazionale della proteina. Tali residui sono stati poi mutati per verificarne l’importanza a livello dell’attività enzimatica e i risultati finali hanno indicato come ciascun singolo residuo sia sufficiente ad indurre i primi steps di attivazione del meccanismo pH-dipendente e come tutti i residui insieme cooperino producendo un effetto cumulativo sull’attività finale dell’enzima.