Development of high-throughput technologies for species of veterinary relevance. Investigation of the genetic basis of mandibular prognathism in the European seabass (Dicentrarchus labrax)

In the last 20 years, the production of farmed marine fish species has increased rapidly, mainly as a consequence of improved breeding methods and technologies. Skeletal malformations and others severe production bottlenecks such as high larval mortality or susceptibility to stress and disease, remain to be solved. Skeletal anomalies in farmed fish are a relevant issue affecting animal welfare and health and cause significant economic losses. The constant progress of genomic technologies promises to rapidly increase our knowledge on molecular mechanisms underlying productive traits of economic relevance in farmed species. The main objective of this PhD research was to investigate the molecular basis underlying the mandibular prognathism (MP), a skeletal malformation with a moderate incidence in intensively reared European seabass (Dicentrarchus labrax). To this aim, we applied a 2bRAD (type IIB endonucleases restriction-site associated DNA) pipeline, a widely used NGS (Next Generation Sequencing) technique for genome-wide genotyping. The reliability and reproducibility of the 2bRAD protocol has been preliminary tested on two organisms of veterinary relevance: the yellowfin tuna (Thunnus albacares), a fish with great biological and economic importance at global scale and the Listeria monocytogenes, a pathogenic bacterium that causes the infection listeriosis. In total, 6772 high-quality genome-wide SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) were identified for the yellowfin tuna, in across population samples collected from the Atlantic, Indian and Pacific oceans and covering the entire distribution area. Discriminant Analysis of Principal Components (DAPC) endorsed the presence of genetically discrete yellowfin tuna populations among three oceanic pools. These results showed the efficiency of this genotyping technique in assessing genetic divergence in a marine fish with high dispersal potential. A total of 1279 unique SNPs loci were identified for Listeria monocytogenes. This research represents a first example of application of RAD-like technologies in microbial genetics. Results obtained for L. monocytogenes suggest that 2b-RAD is an effective tool for molecular epidemiology and public health, as well as proved in other areas such as phylogenetics, taxonomy, population genetics and biosafety. Once the 2bRAD technique was optimized as described above, a high-density genetic map of European seabass for QTL mapping of jaw deformity was constructed and a genome-wide association study (GWAS) was carried out on a total of 298 juveniles, 148 of which belonged to four full-sib families. A total of 7362 SNP markers was genotyped in more than 80% of the experimental population. Three significant QTLs were detected as significantly associated to MP by applying a half-sib regression analysis. The first QTL was located on linkage group LG18, the second one on LG20 and the third on LG22, each of them explaining 11-13% of the phenotypic variation. Two SNPs associated with MP were identified with GWAS analysis. Candidate markers were located on chromosome ChrX and chromosome Chr17, both in close proximity with the peaks of the two most significant QTLs. Notably, the SNP marker on Chr17 was positioned within the Sobp (Sine Oculis Binding Protein) gene coding region, which plays a pivotal role in craniofacial development. The analysis of differentially expressed genes in jaw-deformed animals highlighted the “nervous system development” as a crucial pathway in MP. In particular, Zic2, a key gene for craniofacial morphogenesis in model species, was significantly down-regulated in MP-affected animals. By integrating transcriptomic and GWA methods, the analysis developed during this PhD study, provides evidence for putative mechanisms underlying seabass jaw deformity.

Negli ultimi 20 anni, l’allevamento di specie ittiche marine ha avuto un rapido incremento, grazie principalmente al continuo sviluppo e miglioramento delle tecniche di produzione. Rimangono comunque ancora da risolvere diversi problemi nei processi di produzione, come ad esempio la presenza di malformazioni scheletriche, l'elevata mortalità delle larve o la suscettibilità allo stress e le malattie. Le anomalie scheletriche nei pesci d'allevamento incidono in maniera rilevante anche sul benessere e la salute degli animali, causando notevoli perdite economiche per gli allevatori. Tuttavia, il costante progresso delle tecniche di biologia molecolare e di genetica hanno permesso di ampliare notevolmente le nostre conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di molti caratteri produttivi di rilevanza economica nelle specie allevate. L'obiettivo principale di questo studio è stato quello di indagare le basi genetiche del prognatismo mandibolare (MP), una malformazione scheletrica presente, con una moderata incidenza, negli allevamenti intensivi di branzino (Dicentrarchus labrax). A questo scopo, abbiamo applicato un particolare protocollo di analisi, il 2bRAD (type IIB endonucleases restriction-site associated DNA), ampiamente utilizzato per lo sviluppo di marcatori genetici affiancato a tecniche di sequenziamento massivo NGS (Next Generation Sequencies). L'affidabilità e la riproducibilità del protocollo 2bRAD è stata prima testata su due organismi di una certa rilevanza veterinaria: il tonno pinna gialla (Thunnus albacares), un pesce importante sia dal punto di vista biologico che economico, e la Listeria monocytogenes, un batterio patogeno che può causare la listeriosi. Nel tonno pinna gialla sono stati identificati 6772 marcatori SNP (Single Nucleotide Polymorphism) in popolazioni campionate su tutto l’areale di distribuzione negli Oceani Atlantico, Indiano e Pacifico. L’analisi discriminante delle componenti principali (DAPC) ha permesso di rilevare la presenza di popolazioni distinte di tonno pinna gialla nei tre Oceani. Questi risultati hanno dimostrato quindi l'efficacia del 2bRAD nello studio della divergenza genetica in un pesce marino ad alto potenziale di dispersione. Un totale di 1279 loci SNP sono stati identificati per Listeria monocytogenes, e questo lavoro rappresenta un primo esempio di applicazione di tecnologie “RAD-like” nel campo della genetica microbica. I risultati ottenuti suggeriscono che il 2bRAD potrebbe rivelarsi uno strumento estremamente utile per l'epidemiologia molecolare, così come in altri settori di studio come la filogenesi, la tassonomia, la genetica di popolazione e la salute pubblica. Nel lavoro sul prognatismo mandibolare del branzino, è stata inizialmente sviluppata una mappa di linkage ad alta densità utilizzata per la mappatura dei QTL potenzialmente associati alla patologia; successivamente è stato fatto uno studio di associazione (GWAS) scansionando l’intero genoma di branzino per trovare marcatori SNP putativamente associati al prognatismo. Sono stati utilizzati 298 esemplari giovanili in totale, di cui 148 appartenenti a quattro famiglie full-sib. Un totale di 7362 marcatori SNP sono stati genotipizzati in più del 80% della popolazione sperimentale. Tre QTL significativi sono stati rilevati per il prognatismo utilizzando un’analisi di regressione half-sib. Il primo è stato mappato sul gruppo di linkage LG18, il secondo su LG20 e il terzo sul gruppo di linkage LG22; ogni QTL spiegava circa l’11-13% della variazione fenotipica. Due SNP associati al MP sono stati identificati con l'analisi GWAS. I marcatori candidati sono stati individuati sul cromosoma ChrX e sul cromosoma Chr17, in stretta vicinanza ai due QTL più significativi. In particolare, il marcatore SNP su Chr17 è posizionato all'interno della regione codificante del gene Sobp, che svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo craniofacciale. Inoltre, l’analisi dei geni differenzialmente espressi nei branzini prognati ha evidenziato lo “sviluppo del sistema nervoso" come un pathway cruciale nella formazione del MP. In particolare, Zic2, un gene chiave per la morfogenesi craniofacciale nelle specie modello, risulta significativamente sotto-espresso negli animali affetti da prognatismo. Il lavoro svolto in questo studio quindi, integrando la trascrittomica e l’analisi di marcatori molecolari sviluppati sull’intero genoma, fornisce validi risultati per comprendere meglio i meccanismi molecolari che sono alla base dell’insorgenza del prognatismo mandibolare nei branzini di allevamento.