Studying autophagy-related genes in zebrafish, a crispr/cas9-based approach

Autophagy is an evolutionarily conserved catabolic process in which a cell degrades and recycles, through the lysosomes, long-lived proteins and dismantles organelles in order to maintain cellular homeostasis. This process plays a central role during embryo development, normal physiology and survival during starvation. It is also involved in several human disorders like inflammatory and neurodegenerative diseases, congenital dystrophies, oncogenesis and cancer progression. Autophagy consists of a cascade of steps that are finely regulated and employ a specific subset of proteins two of which, Ambra1 and Epg5, have been the targets of my thesis. Ambra1 is a central positive regulator of the Beclin 1 (BECN1) dependent autophagic process and it is also involved in other cellular processes such as apoptosis, cell proliferation, development and cancer, thanks its capability of binding to other regulatory proteins. Epg5 (ectopic P-granules autophagy protein 5) is required for fusion of autophagosomes with late endosomes and lysosomes. Human recessive mutations of the EPG5 gene have been associated to a rare multisystem disorder called Vici syndrome, mainly characterized by agenesis of the corpus callosum, hypopigmentation, variable immunodeficiency, cardio- and skeletal myopathy and decreased autophagy activity. In this thesis are described the generation, validation and characterization of three zebrafish mutant lines obtained by CRIPR/Cas9 targeted mutagenesis in order to study the autophagic proteins Epg5, Ambra1a and Ambra1b. Moreover, I have validated the specificity of ambra1a- and ambra1b-morpholinos using the Ambra1a mutant line and analysed the involvement of these proteins on heart development by means of these knockdown approach. In chapter I, it is described the generation and characterization of the epg5 zebrafish mutant line, in order to obtain a model for autophagy-related Vici syndrome or autophagy-related diseases. In zebrafish epg5 transcripts were present as maternal mRNA in early stages of development, suggesting a potential role of this protein during embryogenesis. Two epg5 mutant lines were produced, characterized respectively by a deletion of 20 and 13 nucleotides in the first coding exon of the gene. This led, in both cases, to the generation of premature stop codons. Characterization was mainly performed using the -20 nt line. Dysfunctional autophagy was confirmed in the epg5 mutant line, by western blotting experiments, by birefringence and ultrastructural analyses of skeletal muscle, both in fed and starved conditions. All experimental approaches showed that epg5-/- mutants display a marked accumulation of degradation defective autolysosomes and reduction of muscular fibres after starvation. A possible delay in intestinal development was also suggested by goblet cells analysis and by a reduced growth rate during larval stages. epg5-/- mutants display a normal development and reach sexual maturity without exhibiting a clear phenotype. However, after 8-10 months, homozygous mutants show fertility reduction, confirmed by the presence in the ovary of only primary oocytes, alteration in testis morphology together with an impaired motility and muscle thickness reduction. Moreover, in agreement with Vici syndrome, adult mutants present dilated heart and reduction of the compact myocardium. To analyse the autophagy flux in epg5-/-, mutant lines were generated in lc3, rab7, rab5 and lamp1 transgenic backgrounds. Lc3-II puncta (labelling autophagosomes), Lamp1 (labelling mature lysosomes), as well as Rab7 (labelling late endosomes and lysosomes) fluorescence signals were accumulated in muscle of epg5-/- larvae confirming that silencing of Epg5 resulted in block of the autophagic flux. In chapter II it is described the generation of zebrafish mutant lines for the two zebrafish paralogous genes, ambra1a and ambra1b. Differently from results obtained with the corresponding ATG-morpholinos, ambra1a-/- and ambra1b-/- mutant embryos do not display developmental defects. Up-regulation of ambra1b transcripts in ambra1a-/- mutants suggests that there might be a potential compensatory effect of the paralogous genes. Moreover, ambra1a-/- mutants are weakly sensitive to ambra1a-MO but suffer greatly ambra1b-MO knockdown. Lack of adult female in ambra1b-/- line suggests that Ambra1b plays a critical role in zebrafish sex determination and/or ovarian differentiation and development. Although both ambra1a and ambra1b mutants are viable, generation of a stable double Ambra1 mutant line was not possible as double mutant do not survive after larval stages. In chapter III It is described the analysis of ambra1a and ambra1b knockdown effects on cardiac development by means of validated ambra1a and ambra1b ATG-morpholinos, since a previous work showed an involvement of these proteins in this process and both zebrafish ambra1 transcripts are present in the heart region of 2-dpf embryos. Silencing of the two proteins affects heart morphogenesis, resulting in a small, string-like heart with pericardial edema. Treatment with SPLIC-MOs does not result in a clear cardiac phenotype, underlining the importance of maternally supplied ambra1 transcripts. ATGMOs microinjection on a zebrafish transgenic line with green fluorescent heart and WMISH of pitx2c transcripts revealed defects on cardiac looping, indicating that Ambra1 silencing interferes on heart laterality. The cardiac phenotypes were rescued by coinjection of MOs with human AMBRA1 mRNA, pointing to the conservation of Ambra1 functions during evolution. Finally, as it has been suggested a role for Protein phosphatase 2 (PP2A)-mediated dephosphorization in cardiac morphogenesis and development in mouse and rat, and this protein interacts with AMBRA1 to control cell proliferation, co-injection of MOs with hAMBRA1 mRNA and with a messenger mutated in the PP2A binding sites (hAMBRA1PXP mRNA) was used to analyze their rescue effectiveness on heart. Interestingly, coinjections of Ambra1-ATG-MOs with hAMBRA1PXP was not able to rescue the cardiac phenotypes as hAMBRA1 mRNA and treatment of zebrafish embryos with the specific inhibitor of PP2A, cantharidin, resulted in similar developmental cardiac defects. These results suggest a possible role of Ambra1 proteins in heart development, likely involving the interaction with the PP2A phosphatase.

L’autofagia è un processo catabolico evolutivamente conservato in cui la cellula degrada e ricicla, mediante i lisosomi, proteine e organelli non più funzionanti, per mantenere l’omeostasi cellulare. Questo processo svolge un ruolo chiave durante lo sviluppo, la normale fisiologia della cellula e la sopravvivenza in mancanza di nutrienti, ma anche in diverse patologie umane come malattie infiammatorie e neurodegenerative, distrofie congenite, e sviluppo tumorale. L’autofagia si compone di una cascata di passaggi finemente regolati che coinvolgono un insieme specifico di proteine. Due di queste, Ambra1 ed Epg5, sono state l’oggetto della mia tesi di dottorato. La proteina Ambra1 è un regolatore positivo dell’autofagia Beclin 1 (BECN1) dipendente, ma è anche coinvolta in processi quali apoptosi, proliferazione cellulare e sviluppo, grazie alla sua capacità di legare altre proteine regolatrici. Epg5 (Ectopic P-granule protein 5) è invece necessaria nella fase finale del processo autofagico per la fusione degli autofagosomi con gli endosomi tardivi e i lisosomi. Nell’uomo, mutazioni recessive di questo gene sono state associate a un raro disturbo multisistemico, la sindrome di Vici, principalmente caratterizzata da agenesi del corpo calloso, ipopigmentazione oculocutanea, immunodeficienza variabile, cardiomiopatie e miopatie del muscolo scheletrico, e ridotta attività autofagica. In questa tesi descrivo la generazione, validazione e caratterizzazione di tre linee mutanti di zebrafish ottenute mediante la tecnica di mutagenesi mirata CRISPR/Cas9, per studiare le funzioni delle proteine autofagiche Epg5, Ambra1a e Ambra1b. Inoltre, sempre nello zebrafish, ho anche validato la specificità degli oligo morfolino per i geni paraloghi ambra1a e ambra1b, utilizzando la linea mutante ambra1a-/-. Ho inoltre analizzato il coinvolgimento di questi geni paraloghi nello sviluppo del cuore. Nel primo capitolo è descritta la preparazione e caratterizzazione delle linee mutanti per epg5, generate per ottenere un modello di studio per la sindrome di Vici o per altre malattie correlate all’autofagia. Nello zebrafish i trascritti di epg5 sono presenti come eredità materna nei primi stadi dello sviluppo, suggerendo un loro possibile ruolo nello sviluppo dello zebrafish. Sono state generate due linee mutanti, con delezioni rispettivamente di 13 e di 20 nucleotidi nel primo esone codificante, che portano, in entrambi i casi, alla formazione di codoni di stop prematuri. Una completa caratterizzazione della linea è stata condotta solo su quella che presenta la delezione più lunga. Nei mutanti è stato confermato il blocco del processo autofagico, sia in condizioni basali che di digiuno, grazie ad esperimenti di western blotting e analisi sia di birifrangenza che ultrastrutturali del muscolo delle larve. Tutti gli approcci sperimentali hanno mostrato come i mutanti epg5-/- presentino un marcato accumulo di autofagosomi non degradati e una riduzione delle fibre muscolari in seguito al digiuno. Un possibile ritardo nello sviluppo dell’intestino è stato messo in evidenza dall’analisi delle cellule mucipare caliciformi e da una riduzione nel tasso di crescita osservato negli stadi larvali della linea mutante. Nonostante questo, i mutanti epg5-/- si sviluppano normalmente e raggiungono la maturità sessuale privi di un fenotipo evidente. Tuttavia, dopo 8-10 mesi i mutanti presentano una riduzione della fertilità, confermata dalla presenza di soli ovociti primari nell’ovario e di alterazioni nella morfologia dei testicoli, una diminuita motilità e una riduzione delle dimensioni dei muscoli nel tronco. In accordo con la sindrome di Vici, gli adulti presentano inoltre una dilatazione del cuore e riduzione dello spessore del miocardio compatto. Per analizzare il flusso autofagico, sono state generate delle linee epg5-/- in background transgenico per lc3, rab7, rab5 e lamp1. Gli spot fluorescenti Lc3-II (che evidenziano gli autofagosomi), Lamp1 (che evidenziano i lisosomi maturi), come anche quelli Rab7 (negli endosomi tardivi e lisosomi) si accumulano nelle larve epg5-/-, confermando come il silenziamento di Epg5 porti ad un blocco del flusso autofagico. Il secondo capitolo descrive la generazione di linee zebrafish mutanti per i geni paraloghi ambra1a e ambra1b. A differenza dei risultati ottenuti con i corrispondenti ATGmorpholino, gli embrioni mutanti ambra1a-/- e ambra1b-/- non mostrano difetti evidenti durante lo sviluppo. Un aumento della trascrizione del gene ambra1b nei mutanti ambra1a-/- suggerisce un possibile effetto compensatorio tra i due geni paraloghi. Inoltre, i mutanti ambra1a-/- non presentano alterazioni del fenotipo quando iniettati con ambra1a-MO, mentre evidenziano un fenotipo abbastanza severo dopo knockdown con ambra1b-MO. La completa assenza di femmine adulte nella linea mutante ambra1b-/- suggerisce che Ambra1b possa avere un ruolo critico nella determinazione sessuale e/o nello sviluppo e differenziamento dell’ovario. Inoltre, nonostante i mutanti ambra1a-/- e ambra1b-/- siano singolarmente vitali, non è stato possibile ottenere la linea doppia mutante, poiché i pesci con entrambe le mutazioni non sopravvivono oltre lo stadio larvale. Il terzo capitolo descrive l’analisi degli effetti del knockdown con i morfolini ambra1aATG e ambra1b-ATG sullo sviluppo cardiaco. Lavori precedenti avevano infatti mostrato il coinvolgimento di queste proteine nello sviluppo del cuore. Entrambi i trascritti di ambra1 sono presenti nella regione del cuore di embrioni a due giorni dalla fecondazione. Il silenziamento delle due proteine mediante ATG-morfolino modifica in modo evidente lo sviluppo del cuore che risulta più piccolo, di forma allungata e con edema pericardico. La microiniezione di morfolino che agisce sul processo di splicing (SPLIC-MO) non determina alcun fenotipo cardiaco, indicando come in questo processo siano fondamentali i messaggeri materni. Le analisi condotte hanno anche messo in evidenza come il silenziamento di entrambe le forme di ambra1 interferisca con la lateralizzazione del cuore. Il fenotipo cardiaco dei morfanti viene recuperato con successo mediante co-iniezione con il messaggero AMBRA1 umano, risultato che sottolinea la conservazione delle funzioni di questa proteina durante l'evoluzione. Infine, essendo stato suggerito in topi e ratti un ruolo per la defosforilazione mediata da PP2A (Protein Phosphatase 2) nella morfogenesi cardiaca e sapendo che questa proteina interagisce con AMBRA1 per controllare la proliferazione cellulare, sono stati condotti esperimenti di recupero del fenotipo con il messaggero umano di AMBRA1 mutato nel sito di legame per PP2A (hAMBRA1PXP). È interessante notare come questo messaggero non sia in grado di recuperare il fenotipo cardiaco allo stesso modo della co-iniezione con mRNA non mutato suggerendo quindi che il ruolo rivestito dalle proteine Ambra1 nello sviluppo del cuore, sia, almeno in parte, legato all'interazione con la proteina fosfatasi PP2A.