G-quadruplexes (G4s) are non-canonical nucleic acids secondary structures. Their presence has been firmly established in the human genome, as well as in that of many viruses. Our research group has previously identified highly conserved G4s in the U3 region of the HIV-1 genome and the long terminal repeat (LTR) promoter of the proviral genome. In the present work, we addressed how the RNA and DNA HIV-1 G4s can be modulated by various ligands (proteins and chemical compounds), leading to the regulation of important virulence processes. Unveiling so far unknown mechanisms in the HIV-1 infection regulation could help the discovery of new targets for the design of specific inhibitors to be proposed as new antivirals. Initially, we focused on the identification of new RNA G4 binding proteins and the derived modulation. We proved that the HIV-1 nucleocapsid protein (NCp7) binds and unfolds the HIV-1 RNA U3 G4s. Importantly, the NCp7-mediated RNA G4 structure resolution favoured proceeding of the reverse transcription (RT). Conversely, the G4 ligand BRACO-19 (B19) stabilized the RNA G4 folding, thus hindering RT progression, and also counteracting the destabilizing activity of NCp7. On the one hand, our data pointed out the strength of NCp7 as chaperone protein that is able to process the extremely stable HIV-1 RNA G4s in order to allow viral retro-transcription to occur. On the other, they indicate a new target of G4 ligands that inhibit both RT and NCp7. This information brings out the possibility to develop selective U3 RNA G4 ligands, to be proposed as effective anti-HIV-1 drugs with an innovative mechanism of action. We then moved to the investigation of the regulatory role of DNA LTR G4s on viral latency. We reported for the first time the actual folding of the viral LTR G4s within the context of HIV-1 latent chromatin, where the viral promoter is in a repressed state. Moreover, LTR G4s stabilization mediated by two G4 ligands down-modulated viral transcription, thus counteracting viral reactivation from latency. We presented here the possibility to selectively target LTR G4s to control viral latency and develop innovative antiretroviral drugs to manage HIV-1 infection. In this context, targeting LTR G4s constitutes the basis for the progress of new antiviral compounds with an unprecedented mechanism of action. However, the vast majority of G4 binders present high molecular weights and protonated side chains, which may cause bioavailability problems when subjected to in vivo studies. As a consequence, we here investigated the antiviral activity of a new series of Quindoline-derived compounds presenting more drug-like features. Our data highlight the importance to develop small druggable molecules to target viral G4s in order to handle viral infections.

I G-quadruplex (G4s) sono strutture secondarie non canoniche degli acidi nucleici che sono state identificate in regioni regolatorie del genoma umano, così come in quelle di molti virus. Il gruppo di ricerca della Professoressa Richter ha precedentemente identificato strutture G4 altamente conservate nella regione U3 del genoma di HIV-1 e anche in una regione promotoriale del genoma provirale. In questa tesi tratteremo di come i G4 presenti nell’RNA e nel DNA di HIV-1 possano essere modulati da vari ligandi (sia proteine che composti chimici), ottenendo così la modulazione di importanti processi virologici. La scoperta di meccanismi finora sconosciuti nella regolazione dell’infezione da HIV-1 potrebbe portare all’identificazione di nuovi target per la progettazione di specifici inibitori da poter proporre come antivirali. Inizialmente ci siamo concentrati sull’identificazione di nuove proteine in grado di legare gli RNA G4 e sulla loro conseguente modulazione. Abbiamo dimostrato che la proteina virale nucleocapside (NCp7) è in grado di legare e svolgere il G4 nella regione U3 di HIV-1. E’ importante sottolineare che la risoluzione della struttura G4 mediata da NCp7 è stata osservata favorire il processo di trascrizione inversa. Al contrario, il ligando BRACO-19 (B19), stabilizzando il ripiegamento dell’RNA a G4, ha ostacolato la progressione della trascrittasi inversa, anche contrastando l’attività destabilizzante di NCp7. Da un lato, i nostri dati hanno sottolineato la forza della proteina NCp7 come chaperone che risolve le strutture G4 altamente stabili dell’RNA di HIV-1 al fine di consentire la trascrizione inversa virale. Dall’altro lato, abbiamo portato una nuova conseguenza dell’attività del ligando G4, legata all’inibizione dell’attività della trascrittasi inversa e di NCp7. Queste informazioni hanno messo in evidenza la possibilità di sviluppare ligandi selettivi per il G4 dell’RNA U3 di HIV-1 al fine di proporre terapie anti-HIV-1 più efficaci con un meccanismo d’azione innovativo. Siamo poi passati ad indagare il ruolo regolatorio che le strutture G4 nel DNA LTR di HIV-1 possono avere sulla latenza. Abbiamo dimostrato per la prima volta il folding autentico dei G4 virali nell’LTR in un contesto di cromatina latente, in cui il promotore si trova in uno stato inattivo. Inoltre, la stabilizzazione dei G4 dell’LTR mediata da due ligandi G4 ha inibito la trascrizione virale, contrastando così la riattivazione virale dalla latenza. Abbiamo quindi presentato la possibilità di bersagliare selettivamente i G4 virali nell’LTR di HIV-1 per controllare la latenza virale e sviluppare farmaci antiretrovirali innovativi per gestire l’infezione da HIV-1. In questo contesto, colpire selettivamente i G4 dell’LTR costituisce la base per l’avanzamento di nuovi composti antivirali con un meccanismo d’azione senza precedenti. Tuttavia, la maggior parte dei ligandi G4 presenta pesi molecolari elevati e sostituenti protonati che possono causare problemi di scarsa biodisponibilità quando sottoposti a studi in vivo. Di conseguenza, ci siamo focalizzati sullo studio dell’attività antivirale di una nuova serie di composti derivati dalla Quindolina che presentano caratteristiche chimico-fisiche più promettenti. I nostri risultati hanno dimostrato l’importanza di sviluppare piccole molecole per colpire selettivamente i G4 virali al fine di gestire le infezioni virali.

Ligands-mediated modulation of G-quadruplex structures within the HIV-1 genome during lytic and latent state of infection / Soldà, Paola. - (2019 Nov 20).

Ligands-mediated modulation of G-quadruplex structures within the HIV-1 genome during lytic and latent state of infection

Soldà, Paola
2019

Abstract

I G-quadruplex (G4s) sono strutture secondarie non canoniche degli acidi nucleici che sono state identificate in regioni regolatorie del genoma umano, così come in quelle di molti virus. Il gruppo di ricerca della Professoressa Richter ha precedentemente identificato strutture G4 altamente conservate nella regione U3 del genoma di HIV-1 e anche in una regione promotoriale del genoma provirale. In questa tesi tratteremo di come i G4 presenti nell’RNA e nel DNA di HIV-1 possano essere modulati da vari ligandi (sia proteine che composti chimici), ottenendo così la modulazione di importanti processi virologici. La scoperta di meccanismi finora sconosciuti nella regolazione dell’infezione da HIV-1 potrebbe portare all’identificazione di nuovi target per la progettazione di specifici inibitori da poter proporre come antivirali. Inizialmente ci siamo concentrati sull’identificazione di nuove proteine in grado di legare gli RNA G4 e sulla loro conseguente modulazione. Abbiamo dimostrato che la proteina virale nucleocapside (NCp7) è in grado di legare e svolgere il G4 nella regione U3 di HIV-1. E’ importante sottolineare che la risoluzione della struttura G4 mediata da NCp7 è stata osservata favorire il processo di trascrizione inversa. Al contrario, il ligando BRACO-19 (B19), stabilizzando il ripiegamento dell’RNA a G4, ha ostacolato la progressione della trascrittasi inversa, anche contrastando l’attività destabilizzante di NCp7. Da un lato, i nostri dati hanno sottolineato la forza della proteina NCp7 come chaperone che risolve le strutture G4 altamente stabili dell’RNA di HIV-1 al fine di consentire la trascrizione inversa virale. Dall’altro lato, abbiamo portato una nuova conseguenza dell’attività del ligando G4, legata all’inibizione dell’attività della trascrittasi inversa e di NCp7. Queste informazioni hanno messo in evidenza la possibilità di sviluppare ligandi selettivi per il G4 dell’RNA U3 di HIV-1 al fine di proporre terapie anti-HIV-1 più efficaci con un meccanismo d’azione innovativo. Siamo poi passati ad indagare il ruolo regolatorio che le strutture G4 nel DNA LTR di HIV-1 possono avere sulla latenza. Abbiamo dimostrato per la prima volta il folding autentico dei G4 virali nell’LTR in un contesto di cromatina latente, in cui il promotore si trova in uno stato inattivo. Inoltre, la stabilizzazione dei G4 dell’LTR mediata da due ligandi G4 ha inibito la trascrizione virale, contrastando così la riattivazione virale dalla latenza. Abbiamo quindi presentato la possibilità di bersagliare selettivamente i G4 virali nell’LTR di HIV-1 per controllare la latenza virale e sviluppare farmaci antiretrovirali innovativi per gestire l’infezione da HIV-1. In questo contesto, colpire selettivamente i G4 dell’LTR costituisce la base per l’avanzamento di nuovi composti antivirali con un meccanismo d’azione senza precedenti. Tuttavia, la maggior parte dei ligandi G4 presenta pesi molecolari elevati e sostituenti protonati che possono causare problemi di scarsa biodisponibilità quando sottoposti a studi in vivo. Di conseguenza, ci siamo focalizzati sullo studio dell’attività antivirale di una nuova serie di composti derivati dalla Quindolina che presentano caratteristiche chimico-fisiche più promettenti. I nostri risultati hanno dimostrato l’importanza di sviluppare piccole molecole per colpire selettivamente i G4 virali al fine di gestire le infezioni virali.
20-nov-2019
G-quadruplexes (G4s) are non-canonical nucleic acids secondary structures. Their presence has been firmly established in the human genome, as well as in that of many viruses. Our research group has previously identified highly conserved G4s in the U3 region of the HIV-1 genome and the long terminal repeat (LTR) promoter of the proviral genome. In the present work, we addressed how the RNA and DNA HIV-1 G4s can be modulated by various ligands (proteins and chemical compounds), leading to the regulation of important virulence processes. Unveiling so far unknown mechanisms in the HIV-1 infection regulation could help the discovery of new targets for the design of specific inhibitors to be proposed as new antivirals. Initially, we focused on the identification of new RNA G4 binding proteins and the derived modulation. We proved that the HIV-1 nucleocapsid protein (NCp7) binds and unfolds the HIV-1 RNA U3 G4s. Importantly, the NCp7-mediated RNA G4 structure resolution favoured proceeding of the reverse transcription (RT). Conversely, the G4 ligand BRACO-19 (B19) stabilized the RNA G4 folding, thus hindering RT progression, and also counteracting the destabilizing activity of NCp7. On the one hand, our data pointed out the strength of NCp7 as chaperone protein that is able to process the extremely stable HIV-1 RNA G4s in order to allow viral retro-transcription to occur. On the other, they indicate a new target of G4 ligands that inhibit both RT and NCp7. This information brings out the possibility to develop selective U3 RNA G4 ligands, to be proposed as effective anti-HIV-1 drugs with an innovative mechanism of action. We then moved to the investigation of the regulatory role of DNA LTR G4s on viral latency. We reported for the first time the actual folding of the viral LTR G4s within the context of HIV-1 latent chromatin, where the viral promoter is in a repressed state. Moreover, LTR G4s stabilization mediated by two G4 ligands down-modulated viral transcription, thus counteracting viral reactivation from latency. We presented here the possibility to selectively target LTR G4s to control viral latency and develop innovative antiretroviral drugs to manage HIV-1 infection. In this context, targeting LTR G4s constitutes the basis for the progress of new antiviral compounds with an unprecedented mechanism of action. However, the vast majority of G4 binders present high molecular weights and protonated side chains, which may cause bioavailability problems when subjected to in vivo studies. As a consequence, we here investigated the antiviral activity of a new series of Quindoline-derived compounds presenting more drug-like features. Our data highlight the importance to develop small druggable molecules to target viral G4s in order to handle viral infections.
G-quadruplex, HIV-1
Ligands-mediated modulation of G-quadruplex structures within the HIV-1 genome during lytic and latent state of infection / Soldà, Paola. - (2019 Nov 20).
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Soldà_Paola_tesi.pdf

Open Access dal 01/10/2022

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Non specificato
Dimensione 12.08 MB
Formato Adobe PDF
12.08 MB Adobe PDF Visualizza/Apri
Pubblicazioni consigliate

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11577/3422337
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact