Study of the mechanism of action of snake myotoxins

Envenoming resulting from snake bites is a relevant important world public health hazard, especially in tropical and subtropical countries. Particularly in Latin America, the Bothrops genus is responsible for 50–90% of the snakebites. Serum therapy reverses all systemic manifestations of envenoming being efficient against the lethal effect of toxins. In contrast, antivenoms are not very effective in the reversal toxicity induced by phospholipases A2 group toxins, the main components of Bothrops snake venoms. The PLA2 myotoxins can be divided into two principal groups, those with an aspartic acid residue at position 49 endowed with catalytic activity (Asp49 PLA2) and those in which a lysine residue substitutes for aspartic acid at this same position losing the ability to hydrolyze phospholipids (Lys49 PLA2). Even the high amount of studies, little is know about the mechanism of action of myotoxins and this was the main goal of this work. We used C2C12 muscle cells as our cellular model and we focused on calcium-imaging and cell vitality determination techniques. In the first chapter, we showed that the two groups of myotoxins (Asp49 and Lys49 PLA2s) bind to acceptors coupled to intracellular calcium stores; that the PLA2 inactive Lys49 and the PLA2 active Asp49 myotoxins act via different mechanisms in allowing calcium entry into the differentiated muscle cells. This thesis shows for the first time their kinetics of action; and the very important biological finding that the non enzymatically active PLA2 myotoxin synergizes with the active PLA2 myotoxin providing the evolutionary significance for the presence of the two toxin types in the same snake venom. The second chapter shows news clues for the essential role of C-terminal of the Lys49 PLA2 myotoxins. In fact, this peptide region is strongly involved in the membrane permeabilization. Thus, C-terminal region of Lys49 myotoxins is able to cause an extensive and rapid calcium influx leading to muscle cell death within few minutes. In the third chapter the atypical myotoxin from Bothrops jararacussu, bothropstoxin-II, is studied. Although it belongs to the Asp49 group, its PLA2 activity is much lower than other Asp49 PLA2s and it is comparable with Lys49 PLA2 homologues. Beside this, BthTX-II has the ability of act also in absence of calcium in medium, differently from all Asp49 studied until here; demonstrating, for the first time, an atypical Asp49 myotoxin that can disrupt the plasma membrane of myotubes leading to cell death, both in presence or absence of extracellular calcium ions. In the fourth chapter, we described unpublished results regarding the release of intracellular substances by toxin-damaged cells, that alert other cells about a danger situation. We show that B. asper myotoxin-II is able to induce a release of high amounts of ATP from injured cells that is responsible for the amplification of the myonecrosis. At the same time, we also observed a rapid and large potassium efflux that could be involved in pain generation and in some proinflammatory mechanisms. All these results could help to understand the inflammatory pattern also observed in Bothrops envenomations.

Gli avvelenamenti da morso di serpente costituiscono un importante problema di salute mondiale, specialmente nei paesi tropicali e subtropicali. In particolare, nell’ America Latina, il genere Bothrops è responsabile del 50-90% degli incidenti. La sieroterapia è in grado di contrastare tutte le manifestazioni sistemiche del veleno, ma non gli effetti locali quali la mionecrosi diffusa causata da miotossine con attività di fosfolipasi A2, componenti principali del veleno dei serpenti del genere Bothrops. Le miotossine PLA2 sono divise in due principali gruppi, quelle con un acido aspartico nella posizione 49 che hanno attività catalitica (Asp49 PLA2) e quelle dove una lisina sostituisce l’acido aspartico nella stessa posizione causando la perdita della capacità di idrolizzare i fosfolipidi (Lys49 PLA2). Nonostante i tanti studi, il meccanismo d’azione delle miotossine è poco noto; chiarire a livello molecolare come agiscono sul muscolo questo tipo di tossine è stato il principale obiettivo di questo lavoro. A questo scopo è stata utilizzata la linea cellulare C2C12 come modello di cellule muscolari per allestire esperimenti con tecniche di imaging del calcio e determinazione della vitalità cellulare. Nel primo capitolo, si mostra come i due tipi di miotossine (Asp49 e Lys49 PLA2s) si comportano come ligandi di accettori accoppiati agli stores intracellulari di calcio, e che le miotossine PLA2 inattive Lys49 e le PLA2 attive Asp49 agiscono con differenti meccanismi che conducono comunque ad ingresso di ioni calcio nella cellula muscolare differenziata. In questo lavoro si riporta per la prima volta la cinetica d’azione dei due gruppi di tossine, e la scoperta importante che la miotossina PLA2 non enzimaticamente attiva sinergizza con la miotossina PLA2 attiva mostrando il significato evolutivo per la presenza di tutte e due tipi di tossine nello stesso veleno del serpente. Il secondo capitolo porta nuove evidenze a favore del ruolo essenziale del C-terminale delle miotossine PLA2 Lys49. Di fatto, questa regione della molecola è coinvolta nella permeabilizzazione della membrana. Quindi, la regione C-terminale delle miotossine Lys49 è capace di causare un estensivo e veloce influsso di calcio portando la cellula muscolare alla morte in pochi minuti. Nel terzo capitolo viene analizzata una miotossina atipica di Bothrops jararacussu, bothropstoxin-II. Pur essendo una tossina del gruppo Asp49 ha un’attività PLA2 molto ridotta rispetto alle altre Asp49 PLA2s, addirittura confrontabile con le Lys49 omologhe. Oltre a questo, BthTX-II agisce anche in assenza di calcio nel buffer, diversamente da tutte le Asp49 studiate fino ad ora. Si è dimostrato, per la prima volta, che una miotossina Asp49 atipica è capace di perturbare la membrana plasmatica dei miotubi portando alla morte cellulare sia in presenza che in assenza di ioni calcio extracellulari. Nel quarto capitolo, si descrive una parte di lavoro ancora non pubblicata in cu si è studiato il rilascio, indotto da queste tossine, di molecole intracellulari, capaci di segnalare una situazione di pericolo da parte delle cellule danneggiate. È stato mostrato che la myotoxin-II di B. asper induce rilascio di ATP e che esso è responsabile di una amplificazione della mionecrosi. Parallelamente è stato osservato un veloce e significativo efflusso di potassio che può essere coinvolto nella generazione di stimoli dolorifici e nell’attivazione di meccanismi pro infiammatori. Questi risultati contribuiscono a spiegare il quadro infiammatorio che si osserva negli avvelenamenti da Bothrops.