ROLE OF LIPOSOLUBLE HORMONES AND MATERNAL mRNAs IN THE EPIGENETIC LONG-TERM MODULATION OF ZEBRAFISH DEVELOPMENT

PART I: Expression analysis of maternal and zygotic steroid hormone receptor mRNAs during zebrafish (Danio rerio) embryogenesis. I have analyzed by qRT-PCR and/or RT-PCR the abundance and degradation rates of maternal mRNAs for nine steroid hormone receptors and their possible replacement by corresponding embryonic transcripts in both ovulated oocytes and embryos of zebrafish collected at 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 and 48 h post-fertilization (hpf). The mRNAs encoded the nuclear receptors for progesterone (Pr), androgen (Ar), estrogen (Erα, Erβ1 and Erβ2), glucocorticoids (Gr), mineralocorticoids (Mr) and the membrane progestin receptor-α and β (mPrα and β). Gr mRNA was the most abundant maternal transcript in oocytes and early embryos, followed by erβ2 and ar mRNAs. They declined during the first 8 hpf, being replaced, thereafter, by the embryonic messengers. Erβ1 and mr transcript levels were low until 8 hpf, but increased steadily during embryonic transcription from 24 to 48 hpf. Pr transcripts were detectable only in ovulated oocytes and at 24 and 48 hpf. At these stages, there was a slight increase of erα mRNA that initially was very low. Mprα and β mRNAs were expressed in ovulated oocytes and faintly persisted during the first 4 hpf. There was no subsequent embryonic expression of these transcripts. The possible involvement of maternal mRNAs for glucocorticoid and sex hormone receptors in the programming of early zebrafish development is intriguing, since they mainly occur at stages in which gene replication predominates over transcription. PART II: Morpholino knockdown of glucocorticoid receptor in zebrafish during embryogenesis The glucocorticoid receptor (Gr) is involved in various physiological processes, including growth, osmoregulation and reproduction in various species of vertebrates. In this study, I have investigated the function of Gr during zebrafish embryogenesis using antisense Morpholino (MO) technology approach in order to block gr mRNA translation. I observed that Gr-morphants were characterized by small head and eyes, short body, pericardial edema, disrupted melanophore patterning, failure to inflate the swim bladder, tail curling, and abnormal swimming behaviour. The effectiveness of Gr knockdown was further verified by Western blotting and in vitro transcription and translation system, which showed marked reduction of the Gr protein in morphant embryos. Microarray analysis revealed that Gr functions prevalently as a negative regulator of gene transcription. Three genes found to be up-regulated following MO knockdown by microarray analysis, including caspase-8, igf2α and centaurin-1α, were evaluated by semiquantitative RT-PCR throughout the embryonic development. Furthermore, whole mount in situ hybridizations indicated that, whereas marker expression pattern was mostly unchanged in morphant embryos, three markers involved in neurogenesis, egr2b, emx1 and six3.1, were up-regulated. In conclusion, the knockdown of Gr in zebrafish revealed a requirement of both maternal and zygotic gr in multiple developmental processes involved in neurogenesis and gut and accessory organs formation. There are indications that the maternal receptor is critical in early embryogenesis, but more work is needed to elucidate the functional transition from the maternal to the zygotic gr and whether they affect distinctive components of the genetic machinery.

PARTE I: Analisi dell’espressione degli mRNA materni e zigotici per recettori di ormoni steroidei durante lo sviluppo nel pesce zebrato (Danio rerio). Ho analizzato mediante qRT-PCR e/o RT-PCR la presenza ed il grado di degradazione degli mRNA materni codificanti per nove recettori di ormoni steroidei, e la loro possibile sostituzione da parte dei trascritti embrionali corrispondenti, sia negli ovociti ovulati che in embrioni di pesce zebrato raccolti a 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 48 ore dopo la fecondazione (hpf). Gli mRNA studiati sono quelli codificanti i recettori nucleari per il progesterone (Pr), gli androgeni (Ar), gli estrogeni (Erα, Erβ1 ed Erβ2), i glucocorticoidi (Gr), i mineralcorticoidi (Mr) ed i recettori di membrana α e β per i progestinici (mPrα e mPrβ). L’mRNA codificante la proteina Gr costituisce il trascritto materno maggiormente presente negli ovociti e nei primi stadi di sviluppo embrionale, seguito dagli mRNA codificanti i recettori Erβ2 ed Ar. Tutti questi trascritti diminuiscono durante le prime 8 ore di sviluppo, e vengono poi sostituiti dai rispettivi messaggeri embrionali. I livelli dei trascritti per erβ1 e mr sono bassi prima delle 8 hpf, ed aumentano costantemente, dopo l’inizio della trascrizione embrionale, passando dalle 24 alle 48 hpf. L’mRNA codificante il recettore Pr è stato rilevato soltanto negli ovociti ovulati e nei campioni corrispondenti a 24 e 48 hpf. A questi stadi di sviluppo c’è anche un leggero aumento dell’mRNA codificante la proteina Erα. I trascritti per i recettori mPrα e mPrβ sono presenti negli ovociti ovulati e persistono, a basse concentrazioni, fino alle 4 hpf. Non è stata evidenziata la presenza di trascritti embrionali codificanti per questi due geni. E’ interessante il possibile coinvolgimento degli mRNA codificanti Gr e i recettori degli ormoni sessuali nella programmazione dello sviluppo embrionale precoce del pesce zebrato, dal momento che sono presenti principalmente negli stadi di sviluppo in cui la replicazione genica predomina sulla trascrizione. PARTE II: Inattivazione genica del recettore dei glucocorticoidi di pesce zebrato mediante morfolino Il recettore dei glucocorticoidi (Gr) è coinvolto in numerosi processi fisiologici, tra cui la crescita, l’osmoregolazione e la riproduzione in molte specie di vertebrati. In questo studio, ho analizzato la funzione del Gr durante l’embriogenesi di pesce zebrato utilizzando la tecnologia degli oligonucleotidi antisenso morfolino per inibire la traduzione dell’mRNA codificante Gr. Ho osservato che i morfanti di Gr presentano occhi e testa di dimensioni ridotte, corpo corto, edema pericardico, riduzione della pigmentazione, mancata insufflazione della vescica natatoria, coda incurvata e comportamento natatorio anormale. L’efficacia dell’inattivazione genica del Gr sono stati verificati mediante Western blotting ed utilizzando un sistema di trascrizione e traduzione in vitro, che hanno dimostrato una riduzione della traduzione del Gr negli embrioni morfanti. Analisi di microarray hanno messo in evidenza che questa proteina funziona prevalentemente come repressore della trascrizione genica. I geni caspase-8, igf2α e centaurina-1α risultati sovraespressi mediante microarray dopo trattamento con morfolino, sono stati analizzati mediante RT-PCR semiquantitativa durante tutto il corso dello sviluppo embrionale. Inoltre, esperimenti di ibridazione in situ in toto indicano che, mentre in generale il modello di espressione dei marcatori utilizzati non cambia nei morfanti, tre marcatori coinvolti nel processo di neurogenesi, e cioè egr2b, emx1 e six3.1, sono risultati sovraespressi. In conclusione, i risultati ottenuti dall’inattivazione genica del gr di pesce zebrato rivelano la necessità dei trascritti di origine materna in molteplici processi di sviluppo, quali neurogenesi e formazione di intestino ed organi accessori. Si dovrà comunque analizzare più in dettaglio la transizione funzionale dai trascritti materni a quelli zigotici e stabilire se essi influenzino componenti distinti dei meccanismi a livello genomico.