Differentiation potential and metabolic analysis of satellite cells and amniotic fluid stem cells

We have recently characterized two distinct populations of Satellite Cells (SCs), defined as Low Proliferative Clones (LPC) and High Proliferative Clones (HPC), that differ for proliferation, egenerative potential and mitochondrial coupling efficiency. In here, we have deep investigated their cell biology and characterized features that remark their intrinsic differences retrievable also at the initial phases of their cloning. LPC and HPC can indeed be istinguished for characteristic mitochondrial membrane potential (ΔΨm) just after isolation from their parental fibre. This is merged by mitochondrial redox state measured via NAD+/NADH analysis- and alternative respiratory CO2 production in cloned cells, which are accountable for metabolic differences reflected by alternative expression of the glycolytic enzyme Pfkfb3. In addition also mitochondrial Ca2+ handling and the sensitivity to apoptosis triggered via the intrinsic pathway are modified as well as the size of the mitochondrial network. In conclusion, we were able to determine which clone represents the suitable stem cell within the SCs population. These further experimental observations report novel physiological features in the cell biology of SCs populations before and after cloning, highlighting an intrinsic heterogeneity on which the stemness of the satellite cell is likely to depend. In the second part of my work we have also investigated their potential to trans-differentiate into smooth muscle cells. Enteric Nervous System normally interacts with muscle cells to control the peristaltic and secretory activity of the gut wall. Incomplete gut colonization by neural crest cells causes Hirschsprung’s disease, characterized by aganglionosis of the distal bowel. Multipotent, self-renewing enteric precursor neurosphere-like bodies (NLBs) -capable of generating neurons and glia derived from the neural crest- can be isolated from the gut of mice, rats, and human and they are able to colonize the gut after transplantation. Our aim is to understand the relationship between satellite cells-derived muscle precursor cells (MPCs) and NLBs using an in vitro co-culture model: this will be useful in perspective of a tissue engineering approach for bowel regeneration and skeletal muscle. Our records highlighted that NLBs were able to form new myotubes in presence of MPCs. Co-cultures in myogenic medium showed a remarkable improvement of MPCs ifferentiation by NLBs, promoting the formation of sarcomeric striatures onto myotubes and increasing the desmin expression of MPCs. On the other side, using neurogenic medium MPCs-NLBs showed a neural-like phenotype. As future perspectives, we need to understand the relationship between MPCs and NLBs and if the synapses are involved in this process; to verify if the seeding on a biocompatible polymer influences the behaviour of neural cells; and we must confirm these data with an in vivo skeletal and smooth muscle differentiation. We have finally explored the possibility of deriving smooth muscle cells from a different source, taking in consideration the difficulties related to the expansion of both skeletal and smooth muscle progenitors. Therefore, we aim to derive functional smooth muscle cells (SMCs) from non-muscle cells, such as human Amniotic Fluid Stem (hAFSC) cells. hAFSC were transduced using vector encoding ZsGreen under the αSMA promoter. SMhAFSC expressed significantly higher level of smooth muscle genes (such as αSMA, desmin, calponin and smoothelin expression) after selective culture condition. These features were confirmed by immunofluorescence, demonstrating a single lineage commitment; TEM established increased intermediate filaments, dense bodies and glycogen deposits in SMhAFSC, similar pattern compared to SMCs; and sequential imaging analyses demonstrated that SMhAFSC have a higher contractile potential than hAFSC. Consecutive single cell sampling showed the presence of voltagedependent calcium activated potassium channels on differentiated SMhAFSC and showed a higher production of carbon dioxide. In conclusion, we were able to generate to functional SMCs starting from a non-muscle precursor; secondly the transduction process may represent a valuable tool to select SM committed population. This step may eventually overcome the well-known problem of expanding SM progenitors, making these cells amenable to tissue engineering.

Il nostro gruppo ha recentemente caratterizzato due distinte popolazioni di cellule satelliti, classificate come cloni a bassa proliferazione (LPC) e ad alta proliferazione (HPC), che si differenziano in termini di proliferazione, potenziale rigenerativo e metabolismo mitocondriale. Nel mio lavoro di dottorato, abbiamo valutato e caratterizzato la loro biologia cellulare con particolare attenzione a quelle differenze intrinseche presenti anche prima della loro clonazione. Infatti, ambo le tipologie clonali possono essere distinte mediante il potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) subito dopo l’isolamento dalla fibra. Questo dato è in accordo con lo stato ossido riduttivo mitocondriale misurato tramite NAD+/NADH e la quantificazione della produzione di CO2. Questi risultati sono responsabili delle differenze metaboliche e possono essere spiegati dalla diversa espressione dell’enzima glicolitico Pfkfb3. Inoltre la concentrazione mitocondriale del Ca2+ e la sensibilità all’apoptosi sono modificate così come la dimensione della rete mitocondriale. In conclusione, siamo stati in grado di determinare quale clone rappresenta la cellula staminale all’interno della popolazione di cellule satelliti. Queste nuove osservazioni sperimentali rivelano caratteristiche fisiologiche della biologia delle popolazioni delle cellule satelliti prima e dopo la clonazione, mettendo in luce un’eterogeneità intrinseca della cellula satellite. Nella seconda parte della mia tesi abbiamo esplorato la possibilità che le cellule satelliti possano, se opportunamente stimolate, trans-differenziarsi in cellule muscolari lisce. Il sistema nervoso enterico normalmente interagisce con le cellule muscolari per controllare l’attività peristaltica e secretoria della parete intestinale. L’incompleta colonizzazione dell’intestino da parte delle cellule della cresta neurale provoca la malattia di Hirschsprung, caratterizzata da aganglionosi del colon distale. Le neurosfere (NLBs), precursori enterici in grado di auto-rinnovarsi, possono generare neuroni e glia; essere isolate dall’intestino di topi, ratti e umani e sono in grado di colonizzare l'intestino dopo il trapianto. Il nostro obiettivo è di capire la relazione tra i precursori di cellule satelliti (MPCs) e NLBs utilizzando un modello in vitro di co-coltura: questo sarà utile in prospettiva di un approccio di ingegneria tissutale per la rigenerazione intestinale e muscolo scheletrico. I nostri dati hanno evidenziato che NLBs, in presenza di MPCs, sono in grado di formare nuovi miotubi. L’uso di terreni di coltura miogenici ha evidenziato un notevole aumento della differenziazione in senso muscolare, promuovendo la formazione di striature ed aumentando l’espressione di desmina. Dall’altra parte, l’utilizzo di terreni di coltura neurogenici ha mostrato un fenotipo simil neurale. Come prospettive future, dobbiamo comprendere ulteriormente la relazione tra MPCs e NLBs e se le sinapsi sono coinvolte in questo processo; si deve verificare se un loro utilizzo su polimeri biocompatibili ne possa influenzare il comportamento, ed infine è necessaria una conferma dei suddetti dati tramite un’analisi di differenziazione in vivo in muscolo scheletrico e liscio. Nella terza ed ultima fase del mio lavoro, ci siamo focalizzati ad esplorare la possibilità che cellule non-muscolari possano, se opportunamente stimolate, differenziare in senso muscolare liscio. Il nostro obiettivo è stato quello di ottenere cellule muscolari lisce (SMCs) partendo da cellule staminali del fluido amniotico umano (hAFSC). hAFSC sono state trasdotte utilizzando un virus codificante per ZsGreen sotto il promotore αSMA. SMhAFSC così ottenute hanno evidenziate un alto livello d’espressione dei geni del muscolo liscio (come αSMA, desmina, calponina e smoothelin). Queste caratteristiche sono state confermate da molteplici analisi: di immunofluorescenza, dimostrando la positività a marcatori specifici per il muscolo liscio; microscopia a trasmissione elettronica (TEM), dove si verificava l’aumento della presenza di filamenti intermedi, di corpi densi e depositi di glicogeno, modello simile rispetto alle SMCs. Analisi in timelapse di SMhAFSC hanno dimostrato che queste possiedono un potenziale contrattile superiore rispetto hAFSC e studi su singola cellula hanno evidenziato la presenza di canali calcio voltaggio-dipendenti attivati da potassio solamente su SMhAFSC. In conclusione, siamo stati in grado di generare di cellule muscolari lisce funzionali da un precursore nonmuscolare ed in secondo luogo il processo di trasduzione può rappresentare un valido strumento per distinguere e selezionare differenti popolazioni. Questa fase può eventualmente superare il ben noto problema dell’espansione di progenitori di cellule muscolari lisce, rendendo queste cellule suscettibili per approcci d’ingegneria tessutale.