Central nervous system neuronal surface antibody-associated syndromes. Clinical and Laboratory Characterization

The concept of antibody–associated central nervous system (CNS) disorders is relatively recent. The classical CNS paraneoplastic neurological syndromes are thought to be T-cell mediated, and the onconeural antibodies merely biomarkers for the presence of the tumour. Accordingly it was thought that antibodies rarely, if ever, caused CNS disease. Recently, however, it has become increasingly clear that there are CNS syndromes associated with antibodies that bind to cell surface determinants on neuronal cells and are likely to be pathogenic. Over the last ten years identification of autoimmune forms of encephalitis with antibodies against neuronal surface (NS) antigens, particularly the VGKC-complex proteins or the glutamate NMDA receptor, have shown that CNS disorders, often without associated tumours, can be antibody-mediated and benefit from immunomodulatory therapies. The clinical spectrum of these diseases is not yet fully explored, there may be others yet to be discovered, and some types of more common disorders, as epilepsy or psychosis, may prove to have an autoimmune basis. Here, we call these antibodies neuronal surface antibodies (NSAbs), and the diseases associated with them NSAb syndromes or NSAS. The aim of the research performed in the three years of PhD study has been to characterize NSAS from both a laboratory and a clinical point of view. The first year of the PhD was spent at the Oxford laboratory under the supervision of Prof. Angela Vincent. During this period I contributed to the laboratory characterization of the two most important groups of NSAS: encephalitis associated with VGKC-complex-Abs and NMDAR-Abs. The results of these studies have been published (Irani et al., Brain 2010a; Irani et al., 2010b). My personal contribution in these studies included the development and optimization of immunofluorescence techniques for the detection of autoantibodies against neuronal surface antigens (NSAbs) using both primary cultures of rat hippocampal neurons and mammalian cells transfected with the antigen of interest. In addition, during my time at Oxford I investigated a possible novel proteomics approach to identify new NSAb by means of immunoprecipitation and mass spectrometry. These experiments have subsequently been applied to screen samples of patients with autoimmune cerebellar syndromes. The results of this study are described in the third part of the thesis. The doctoral thesis is divided into three parts. In the first part I have reviewed the state of the art of syndromes associated with neuronal surface antibodies, starting with a comparison of the conditions associated with antibodies to intracellular antigens and those associated with antibodies to cell surface antigens. I have then summarised the main clinical and paraclinical features of the syndromes that have already been identified. On the basis of these observations, I have designed guidelines for recognizing these and other immune-mediated conditions in the future. The guidelines work has been supervised by Prof. Angela Vincent (Oxford, UK) and critically reviewed by Prof. Francesc Graus (Barcelona, Spain), Prof. Christian Bien (Bielefeld, Germany) and Dr. Bruno Giometto (Treviso, Italy). The second part of the thesis describes the clinical and immunological characterization of a cohort of patients with suspected autoimmune encephalitis and VGKC-complex-Abs that I collected and reviewed in Padua during the 3-year period of the PhD. Recently the Oxford group showed that most antibodies previously attributed to VGKC (by radioimmunoprecipitation) target two proteins complexed with the channels Lgi1 and Caspr2, which also tend to associate with LE and Morvan’s syndrome phenotypes, respectively (see (Irani et al., Brain 2010b)). I therefore decided to focus my research on patients with autoimmune encephalitis associated with ‘VGKC’-complex-Abs in order to report their clinical and immunological profile, with a view to showing a possible antigen-phenotype correlation. During the 3-year period of my PhD, I screened 503 samples for NSAbs from 366 patients with suspected autoimmune encephalitis sent to our laboratory between January 2005 and December 2011: 279 serum (and cerebrospinal fluid) samples from 232 patients were tested for VGKC-complex-Abs; in addition 226 samples were tested for NMDAR-Abs, 59 for AMPAR1,2- and GABAbR-Abs, 91 for GAD-Abs; 21 samples were also tested on live hippocampal neurons. Screening methods included: radioimmunoprecipitation (RIA) assay for VGKC-Abs and GAD65-Abs; cell-based assay for antibodies binding human NMDAR, AMPAR1, AMPAR2, GABAbR, Lgi1 and Caspr2; indirect immunofluorescence on live hippocampal cell cultures. Thirty-two of the 232 patients tested for VGKC-complex-Abs were positive. Clinical data were available for 18 patients: 10 patients harboured Lgi1-Abs in their sera, 3 Caspr2-Abs, 5 patients were positive on RIA but not on IIF. Two patients had Morvan’s syndrome, one associated with Lgi1-ab and the other with Caspr2-Ab and a thymoma. Response to immune modulation was reported in all patients with the exception of a patient who died from lung cancer. A consistently high VGKC-complex-Abs titre despite clinical remission prompted the discovery and subsequent removal of an enlarged hyperplastic thymus in a patient with Lgi1-Abs associated LE; one Caspr2-Abs positive patient had mild encephalitis overlapping with an anti-phospholipid syndrome; another patient with an immunotherapy-responsive encephalomyelitis tested negative on IIF but had high-titre VGKC-complex-Abs on RIA. Striatal hypermetabolism was found in 4 patients with Lgi1-Abs in one case associated with faciobrachial dystonic seizures. In conclusion, these results have expanded the clinical spectrum of autoimmune encephalopathy associated with VGKC-complex antibody. It has been shown that VGKC-LE can associate not only with thymomas, but also with a hyperplastic thymus, similarly to the well-known finding in myasthenia gravis and therefore that the persistence of high VGKC-Abs titres should prompt the search for an enlarged thymus. The third part of the thesis describes a study whose aim was to identify new autoantibodies in cerebellar syndromes of possible autoimmune origin. Dr. Esther Becker from Oxford University contributed equally to me in this work. Relatively few studies have searched for potentially pathogenic antibodies in non-paraneoplastic patients with cerebellar ataxia. We first screened sera from more 52 idiopathic ataxia patients for the binding of serum IgG antibodies to cerebellar neurons. One strong-binding serum was selected for immunoprecipitation and mass spectrometry, which resulted in the identification of contactin-associated protein 2 (Caspr2) as a major antigen. Caspr2 antibodies were then found by a cell-based assay in 9/88 (10%) ataxia patients, compared to 3/144 (2%) multiple sclerosis or dementia controls. Caspr2 is strongly expressed in the cerebellum, only partly in association with voltage-gated potassium channels. Prospective studies are needed to see whether identification of Caspr2-antibodies has relevance for the diagnosis and treatment of idiopathic cerebellar ataxia.

Il concetto di sindromi del sistema nervoso centrale (SNC) associate ad anticorpi è relativamente recente. Si ritiene che le classiche sindromi paraneoplastiche neurologiche abbiano una patogenesi immunitaria prevalentemente cellulo-mediata e che gli anticorpi onconeurali costituiscano semplicemente dei biomarker. Sulla base di questo assunto si è ritenuto a lungo improbabile che autoanticorpi potessero determinare malattie del SNC. Recentemente si è resa sempre più evidente l’esistenza di sindromi del SNC associate ad anticorpi diretti contro antigeni presenti sulla superficie neuronale e pertanto potenzialmente patogenetici. L’identificazione negli ultimi dieci anni di forme di encefaliti autoimmuni con anticorpi diretti contro antigeni della superficie neuronale, ed in particolare le proteine del complesso dei canali del potassio voltaggio-dipendenti (VGKC-complex) e i recettori del glutammato di tipo NMDA, ha dimostrato l’esistenza di sindromi del SNC, generalmente non associate alla presenza di neoplasie, che possono essere anticorpo-mediate e pertanto potenzialmente trattabili. Lo spettro clinico di queste malattie non è stato ancora pienamente esplorato, vi potrebbero essere altre malattie che devono ancora essere scoperte, e vi sono forme di epilessia o sindromi psichiatriche che potrebbero avere una base autoimmune. Definiamo questi anticorpi neuronal surface antibodies (NSAbs) e le malattie ad essi associate NSAS (Neuronal Surface Antibody Syndrome). Lo scopo della ricerca effettuata in questo percorso di tre anni di dottorato è stato la caratterizzazione clinica e laboratoristica di alcune NSAS. Il primo anno di dottorato è stato effettuato presso l’Università di Oxford sotto la supervisione della Prof. Angela Vincent. Durante questo periodo ho contribuito alla caratterizzazione delle due più importanti forme di NSAS, le encefaliti associate ad anticorpi anti-VGKC-complex e ad anti-NMDAR. I risultati di questi studi sono stati pubblicati (Irani et al., Brain 2010 a e b). Il mio personale contributo è consistito nello sviluppo e ottimizzazione di tecniche di immunofluorescenza per l’identificazione di NSAbs, utilizzando sia colture primarie di neuroni ippocampali che cellule di mammifero transfettate con l’antigene di interesse. Inoltre durante il soggiorno presso il laboratorio di Oxford ho cercato di mettere a punto un approccio di proteomica per l’identificazione di nuovi NSAbs mediante immunoprecipitazione e spettrometria di massa. Tale approccio è stato successivamente applicato nello screening di pazienti con sindromi cerebellari autoimmuni. I risultati di questo studio sono descritti nella terza parte della tesi. La tesi di dottorato è divisa in tre parti. Nella prima parte ho esaminato lo stato dell’arte delle sindromi associate ad anticorpi contro antigeni di superficie iniziando con un confronto tra disordini associati ad anticorpi contro antigeni intracellulari e antigeni di superficie. Ho quindi riassunto i maggiori aspetti clinici e paraclinici delle sindromi che sono state già identificate, e da queste osservazioni ho disegnato delle linee guida per il futuro riconoscimento di queste e altre condizioni potenzialmente mediate da NSAbs. Il lavoro di stesura di queste linee guida è stato supervisionato dalla Prof. Angela Vincent e riesaminato criticamente dai Prof. Francesc Graus (Barcelona, Spain) e Prof. Christian Bien (Bielefeld, Germany) e dal Dr. Bruno Giometto (Treviso, Italy). La seconda parte della tesi descrive la caratterizzazione clinica e immunologica di una coorte di pazienti con sospetta encefalite autoimmune e anticorpi anti-VGKC-complex che ho raccolto ed esaminato a Padova nei 3 anni di dottorato. Recentemente è stato dimostrato dal gruppo di lavoro di Oxford che la maggior parte degli anticorpi precedentemente attribuiti ai canali del potassio VGKC (mediante immunoprecipitazione) in realtà hanno come bersaglio due proteine canale complessate con i VGKC, Lgi1 e Caspr2; anticorpi diretti contro queste due proteine tendono ad associarsi rispettivamente con encefalite limbica (EL) e sindrome di Morvan (vedi Irani et al. Brain 2010b). Ho quindi deciso di focalizzare la mia indagine su pazienti con encefaliti autoimmuni associate ad anticorpi anti-VGKC-complex con l’obiettivo di riportare il profilo clinico e immunologico di questi pazienti e possibilmente dimostrare una correlazione tra antigene e fenotipo. Durante i tre anni di dottorato ho analizzato 503 campioni da 366 pazienti con sospetta encefalite autoimmune inviati al nostro laboratorio tra gennaio 2005 e dicembre 2011: 279 campioni di siero (e/o di liquido cerebrospinale) da 232 pazienti sono stati testati per anti-VGKC-complex; inoltre 226 campioni sono stati testati per anticorpi anti-NMDAR, 59 per anti-AMPAR1 e 2 e GABAbR, 91 per anti-GAD; 21 campioni inoltre sono stati testati su neuroni ippocampali. Le metodiche di screening hanno incluso: radioimmunoprecipitazione (RIA) per anti-VGKC e -GAD65; immunofluorescenza indiretta (IFI) su cellule transfettate con NMDAR, AMPAR1, AMPAR2, GABAbR, Lgi1 and Caspr2; IFI su neuroni ippocampali. I dati raccolti dai pazienti risultati positivi per anti-VGKC-complex sono quindi stati analizzati. Trentadue pazienti su 232 testati sono risultati positivi per anti-VGKC-complex. Informazioni cliniche sono risultate disponibili per 18 pazienti: 10 positivi per anti-Lgi1, 3 per anti-Caspr2 mentre 5 sono risultati positivi su RIA ma non su IFI. Due pazienti hanno presentato un quadro sindromico compatibile con la sindrome di Morvan, in un caso in associazione ad anti-Lgi1 e nell’altro ad anti-Caspr2 e timoma. In tutti i pazienti in cui è stato somministrato un trattamento immunomodulante si è assistito ad un miglioramento clinico con l’eccezione di una paziente deceduta a causa di un microcitoma polmonare. Un titolo anticorpale persistentemente elevato nonostante la remissione clinica in una paziente con EL e anticorpi anti-Lgi1 ha condotto all’individuazione e alla successiva rimozione di un timo iperplastico; un paziente con anti-Caspr2 ha manifestato un’encefalite di grado lieve in concomitanza di una sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi; un altro paziente con una forma di encefalomielite responsiva al trattamento è risultato negativo in IFI ma ha presentato un alto titolo anticorpale per anti-VGKC su RIA. Un ipermetabolismo dei gangli della base è stato individuato in 4 pazienti con anti-Lgi1, in un caso associato alla presenza di crisi epilettiche distoniche facio-brachiali. In conclusione i risultati di questo studio hanno esteso lo spettro delle manifestazioni cliniche note associate ad anticorpi anti-VGKC-complex. E’ stato dimostrato che le EL con anti-VGKC possono associare non solo a timomi ma anche ad iperplasia del timo, in maniera analoga a quanto avviene nella miastenia gravis. La persistenza di un alto titolo anticorpale dovrebbe pertanto indurre un accurato imaging del timo. La terza parte della tesi descrive uno studio sperimentale che ha avuto lo scopo di identificare nuovi autoanticorpi nelle sindromi cerebellari di possibile origine autoimmune. La Dr.ssa Esther Becker dell’Università di Oxford ha contribuito in egual misura al sottoscritto in questo studio. Pochi studi in precedenza avevano ricercato anticorpi potenzialmente patogenetici in pazienti non paraneoplastici con atassia cerebellare. Inizialmente 52 pazienti con atassia cerebellare idiopatica sono stati sottoposti a screening mediante immunofluorescenza su neuroni cerebellari. Un siero che ha dimostrato un intensa reattività sui neuroni è stato selezionato per gli esperimenti di immunoprecipitazione e spettrometria di massa. Tale approccio ha portato all’identificazione di Caspr2 (contactin-associated protein 2) come maggiore antigene. Anticorpi anti-Caspr2 sono stati poi identificati mediante immunofluorescenza su cellule transfettate in 9 pazienti su 88 con atassia (10%), in confronto a 3 pazienti su 144 di controllo affetti da sclerosi multipla o demenza. Caspr2 è altamente espresso nel cervelletto, e solo in parte in associazione ai canali del potassio voltaggio-dipendenti. Studi prospettici saranno necessari per valutare se l’identificazione di anticorpi anti-Caspr2 abbia valore nella diagnosi e trattamento delle sindromi cerebellari.