Analysis of the molecular and phenotypic effects mediated by brain tumour microenvironment on glioblastoma derived cells through in vitro and in vivo models.

Glioblastoma multiforme (GBM) is one of most common and still poorly treated primary brain tumors. One of the biggest challenges in brain tumour research is the possibility of reprogramming cancer cells toward less aggressive phenotypes. To reach this aim however, a more complete understanding of the biology of GBM cells is needed, in particular considering the role played by hypoxia as a signaling pathways regulator. In search for new therapeutic approaches, Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) have been demonstrated to induce astroglial commitment in GBM-derived cells in vitro. The mTOR pathway represent a controversial link between the pro-stemness hypoxic pathway and the pro-differentiating BMPs pathway. Indeed, HIF-1α is controlled at the transcriptional and translational level by mTOR and, alike BMP, also mTOR pathway modulates glial differentiation in central nervous system (CNS) stem cells. Here, we investigate the role of mTOR signaling in the regulation of HIF-1α stability in primary GBM-derived cells maintained under hypoxia (2% oxygen). We found that GBM cells, when acutely exposed to high oxygen tension, undergo Akt/mTOR pathway activation and that BMP2 acts in an analogous way. Importantly, repression of Akt/mTOR signaling is maintained by HIF-1α through REDD1 upregulation. On the other hand, BMP2 counter-acts HIF-1α stability by modulating intracellular succinate and by controlling proline hydroxylase 2 (PHD2) protein through inhibition of FKBP38, a PHD2 protein regulator. Despite being encouraging, these data suggested that hypoxia, which is characteristic of the brain niche where GBM reside, strongly counter-acts BMP effects; so a new therapeutic approaches able to counteract tumour growth also in its hypoxic microenvironment is fundamental. In the second part of this study, we reprogrammed primary GBM-derived cells toward a less oncogenic phenotype by activating Wnt pathway in GBM hypoxic microenvironment, that usually correlates with a malignant behaviour of cancer cells. We demonstrate that exogenous Wnt3a ligand mediates neuronal differentiation and proliferation inhibition of GBM cells and that this phenomenon is enhanced under hypoxic conditions by HIF-1α- mediated up-regulation of β-catenin co-factors TCF1 and LEF1. Moreover, we show that Wnt pathway activation inhibits Notch signalling, thus enhancing the prodifferentiating effects exerted by the Wnt activated pro-neuronal genes NEUROD1 and 4 NEUROG1, and that this occurs mainly in the GBM cancer stem cell subpopulation (CD133+). By using a zebrafish-based protocol for orthotopic xeno-transplantation of primary GBM-derived cells, we show that Wnt pathway activation is able to promote neuronal differentiation of GBM cells by inhibiting Notch signalling also in an in vivo setting. Conclusions: In this study we elucidate the molecular mechanisms by which two prodifferentiating stimuli, BMP2 and acute high oxygen exposure, control HIF-1α stability. We previously reported that both these stimuli, by inducing astroglial differentiation, affect GBM cells growth. We also found differences in high oxygen and BMP2 sensitivity between GBM cells and normal cells that should be further investigated to better define tumor cell biology. Moreover, we add more information in the epistatic relationship between HIF-1α, Wnt and Notch signalling in GBM-derived cells, demonstrating a Wnt-regulated suppression of Notch activity in the hypoxic microenvironment of GBM tumours. The third part of my PhD study focused on Medulloblastoma (MDB) which is the most common brain malignancy of childhood. It is currently thought that MDB arises from aberrantly functioning stem cells in the cerebellum that fail to maintain proper control of self-renewal. Additionally, it has been reported that MDB cells display higher endogenous Notch signalling activation, known to promote the survival and proliferation of neoplastic neural stem cells and to inhibit their differentiation. While interaction between Hypoxia Inducible Factor-1α (HIF-1α) and Notch signalling is required to maintain normal neural precursors in an undifferentiated state, an interaction has not been identified in MDB. Here, we investigate whether hypoxia, through HIF-1α stabilization, modulates Notch1 signalling in primary MDB-derived cells. Our results indicate that MDB-derived precursor cells require hypoxic conditions for in vitro expansion, whereas acute exposure to 20% oxygen induces tumor cell differentiation and death through inhibition of Notch signaling. Importantly, stimulating Notch1 activation with its ligand Dll4 under hypoxic conditions leads to expansion of MDBderived CD133+ and nestin+ precursors, suggesting a regulatory effect on stem cells. In contrast, MDB cells undergo neuronal differentiation when treated with γ-secretase inhibitor, which prevents Notch activation. 5 Conclusions. These results suggest that hypoxia, by maintaining Notch1 in its active form, preserves MDB stem cell viability and expansion. Significance: We add new insights in the regulation of brain tumour stem cells and contribute to clarify the complex relationship between diverse signalling pathways in controlling GBM cell phenotype.

Il Gliobalstoma multiforme (GBM) è il più comune dei tumori cerebrali nell’adulto, con una prognosi ancora oggi particolarmente infausta e senza trattamenti efficaci. Una delle grosse sfide da affrontare nella ricerca sui tumori cerebrali è la possibilità di riprogrammare queste cellule verso un fenotipo meno aggressivo. Per raggiungere questo scopo tuttavia è necessaria una più ampia e completa conoscenza della biologia di questo tumore, in particolare del ruolo dell’ipossia come regolatore delle principali pathways coinvolte nel modulare il fenotipo delle cellule di GBM. Nella ricerca di nuovi approcci terapeutici, le Bone Morphogenetics proteins (BMPs) si sono dimostrate efficaci nell’indurre un differenziamento astrogliale delle cellule di GBM in vitro. Il pathway di mTOR rappresenta un collegamento controverso fra il mantenimento della staminalità, mediato dall’ipossia, e il differenziamento mediato dal BMP pathway. Infatti l’Hypoxia Inducible Factor-1α (HIF-1α) è controllato a livello trascrizionale e traduzionale dalla proteina mTOR e, come il BMP, lo stesso mTOR pathway modula il differenziamento gliale delle staminali neurali nel sistema nervoso centrale. In questo studio abbiamo valutato il ruolo del pathway di mTOR nel regolare la stabilità di HIF- 1α in cellule primarie derivate da GBM e mantenute in ipossia (2% O2). Abbiamo dimostrato che, quando esposte ad alte tensioni di ossigeno (20% O2), le cellule di GBM attivano il pathway di Akt/mTOR e che la somministrazione del BMP2 promuove effetti analoghi. In particolare, abbiamo dimostrato che HIF-1α reprime il pathway di Akt/mTOR attraverso la up-regolazione della proteina Redd1, inibitore di mTOR. In maniera opposta, BMP2 contrasta la stabilità di HIF-1α modulando I livelli intracellulari di succinato e controllando i livelli di proline hydroxylase 2 (PHD2), 6 attraverso l’inibizione di FKBP38, una proteina regolatoria della PHD2. nonostante siano incoraggianti, questi dati suggeriscono che l’ipossia, caratteristica della nicchia dei tumori cerebrali, contrasta fortemente gli effetti del BMP2; quindi un approccio terapeutico in grado di arrestare la crescita tumorale anche nel suo microambiente ipossico è fondamentale. Nella seconda parte dello studio, l’intento è stato quello di riprogrammare cellule primarie derivate da GBM verso un fenotipo più differenziato e meno aggressivo attivando il Wnt pathway nel loro microambiente ipossico, solitamente correlato con la malignità delle cellule tumorali. Abbiamo dimostrato che la somministrazione esogena del ligando Wnt3a media il differenziamento neuronale e l’inibizione della proliferazione nelle cellule di GBM e che questo fenomeno è più forte in condizioni ipossiche grazie ad una up-regolazione dei co-fattori della β-catenina TCF1 and LEF1. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’attivazione del Wnt pathway inibisce il segnale intracellulare di Notch, incrementando gli effetti pro-differenziativi del Wnt che attiva per-se i geni pro-neuronali NEUROD1 e NEUROG1. In particolare, questi effetti si esplicano nella sottopopolazione cellulare tumorale staminale (CD133+). Per valutare gli effetti dell’attivazione di questa pathway in vivo abbiamo messo a punto un protocollo di xeno-trapianto ortotopico di cellule primarie derivate da GBM in larve di Zebrafish (Danio Rerio). Le evidenze ci dimostrano che l’attivazione del Wnt pathway è in grado di promuovere il differenziamento neuronale delle cellule di GBM e di inibire il Notch pathway anche nel contesto di un modello animale. Conclusione: in questo studio abbiamo delucidato i meccanismi molecolari attraverso cui due stimoli pro-differenziativi, BMP2 e osiigeno, controllino la stabilità di HIF-1α. Abbiamo riportato in precedenti lavori che entrambi questi stimoli inducono il differenziamento astro gliale e bloccano la crescita delle cellule di GBM. Abbiamo inoltre evidenziato le differenze tra cellule tumorali di GBM e cellule staminali neurali sane nella risposta agli stimoli pro-differenziativi, divergenze di risposta che richiedono ulteriori indagini per meglio definire la biologia del tumore. Inoltre, abbiamo delucidato la relazione epistatica che intercorre tra HIF-1α, Wnt e Notch in cellule derivade da glioblastoma, dimostrando come Wnt regoli la soppressione del Notch pathway nel microambiente ipossico dei glioblastomi. 7 La terza parte del mio progetto di dottorato si è focalizzata su un tumore cerebellare pediatrico di origine neuronale classificato come Medulloblastoma (MDB), che si riscontra essere il più frequente fra i tumori cerebrali pediatrici. Le più recenti ricerche rivelano che il MDB deriva da cellule staminali del cervelletto che proliferano in maniera aberrante perdendo il controllo della loro capacità di auto-rinnovamento. E’ stato inoltre riportato che cellule di MDB hanno una elevata attivazione endogena del Notch signalling, noto per promuovere proliferazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali neoplastiche e per inibire il loro differenziamento. Se l’interazione fra HIF-1α e il Notch signalling ha la funzione di mantenere i precursori neurali sani in uno stato indifferenziato, la loro interazione nelle cellule di MDB non è ancora stata caratterizzata. In questo studio abbiamo analizzato se l’ipossia, stabilizzando HIF-1α, modulasse il signalling di Notch1 in cellule primarie derivate da MDB. I nostri risultati indicano che cellule staminali derivate da MDB richiedono un ambiente ipossico per la loro espansione in vitro, mentre un’esposizione acuta delle stesse al 20% di ossigeno induce il differenziamento delle cellule tumorali e la loro morte attraverso l’inibizione del Notch1. Da notare che attivando Notch1 con il suo ligando DLL4 in condizioni ipossiche si ha un’espansione di precursori CD133+ e Nestina+ del MDB, suggerendo un effetto regolatorio di questo pathway sulla sotto-popolazione staminale. Al contrario, cellule di MDB vanno incontro a differenziamento neuronale quando trattate con un inibitore della γ-secretase che previene l’attivazione del Notch. Conclusione: Questi risultati suggeriscono che l’ipossia, attivando il signalling intracellulare di Notch, preserva le cellule staminali di MDB e ne promuove l’espansione. Significato: Con questo lavoro abbiamo cercato di definire la complessa regolazione che modula il fenotipo delle cellule staminali tumorali e abbiamo contribuito a chiarire la interrelazione fra i diversi signalling pathway che controllano fenotipo e comportamento delle cellule derivate da tumore cerebrale.