Studies on polymer conjugation as versatile tool for drug delivery

Drug delivery is a rapidly evolving field aimed to maximize the potential and safety of therapeutic agents. The project of this thesis focused on development and characterization of drug delivery systems (DDSs), based on polymeric carriers. Among, the advantages of these systems it is possible to list an increased solubility, a prolonged exposure of the drug, a protection from enzymatic degradation and a controlled release of drug and an accumulation in diseased tissues. The DDSs developed here were firs tested in the context of cancer therapy where the delivery, controlled release and targeting are important issues. Nevertheless these systems can also be applied to tissue engineering where the same issues are important for the development of scaffolds capable of releasing growth factors for cells. This work was divided into two studies. The first study focused on the comparison of the biological behavior (in vitro cytotoxicity, cellular uptake and pharmacokinetic properties in vivo) of five polymer-drug conjugates diversified for the types of polymeric carrier and containing Epirubicin as a model anticancer drug, conjugated via amide bond. The carriers were distinguished on: non-biodegradable (N-(2-hydroxypropyl) metacrylamide copolymers (HPMA) with either the enzymatic cleavable linker GPLG or the stable GG and poly(ethylene glycol) (PEG)) and biodegradable polymers (poly(L-glutamic acid) (PGA) and polysialic acid (PSA)). After characterisation in terms of purity and stability under physiological conditions, all conjugates were tested in vitro on MCF-7 (human breast cancer cells) and MCF-7/Dx (human breast cancer cells with resistance to anthracyclines). In MCF-7, all conjugates were relatively non-cytotoxic at the concentrations tested as expected for the type of conjugates synthesized. In the case of the two biodegradable conjugates some cytotoxic activity degree was still observed (approximately 40% reduction of viability at a concentration of 1µM, for both polysialic acid and polyglutamic acid). PEG-EPI, HPMA-GPLG-EPI, HPMA-GG-EPI and PGA-EPI were also inactive in multidrug-resistant sub-line (MCF 7/Dx), while PSA-EPI reduces of 30% cell viability at the concentration of 1 µM. Studies performed with FACS, in the presence of selective inhibitors of different mechanisms of endocytosis, allowed to understand that all conjugates were internalized by endocytosis cholesterol-dependent suggesting that uptake is not responsible for the different pattern of cytotoxicity observed. Finally, pharmacokinetic studies performed in vivo in mice Balb/c, shown a significantly increased half-life of the conjugates compared to free drug. The second study focused on the synthesis and characterization of target polymer-drug conjugates, based on a PEG with a defined dendritic structure for delivery of the anticancer drug paclitaxel (PTX). The structure of PEG Dendron offer the possibility to obtain defined chemical structure in terms of drug and targeting moiety contents. Furthermore, it was hypothesized that by synthesizing a heterobifunctional PEG-dendrimer, namely NH2-PEG- βGlu-(βGlu)2-(COOH)4, it could be possible to obtain a conjugate with a high degree of homogeneity, thus impacting positively on both the targeting and activity properties. The heterobifunctional PEG allows the subdivision of targeting and activity functions by linking PTX and ALN at the two different end chains of the polymers. This design leads to the obtainment of an amphiphilic conjugate, being PTX highly hydrophobic and ALN hydrophilic. The spatial separation of these drugs, besides offering the possibility to form self-assembled micelles, will maintain all ALN molecules exposed to the water, promptly available for binding to the bone mineral hydroxyapatite. Paclitaxel was conjugated via ester bond, through a succinic spacer, at one end of PEG, while, at the opposite end, four molecules of alendronate were linked, to obtain a bone targeting. In addition, the conjugates can accumulate in tumor by passive targeting, because their high molecular weight allows to accumulate in the tumor tissue thanks to a preferential extravasation in solid tumors due to blood vessels high permeability, also known as EPR effect (Enhanced Permeability and Retention). All conjugates synthesized were characterized in terms of amount of PTX and ALN content, purity and stability under physiological conditions. These conjugates showed a 50% of degradation after 1 hour of incubation at pH 7.4 and in plasma, confirming that, the type of bond, allows the drug release under physiological conditions. The conjugates-based PTX and ALN have also been shown high affinity for hydroxyapatite in vitro, confirming the potential of alendronate as target agent, and cytotoxic activity similar to free drug or in combination with alendronate in 4T1 cells (murine mammary adenocarcinoma cells line), MDA-MB-231 (human mammary adenocarcinoma cells line) and PC3 (human prostate adenocarcinoma cells line). Anti-angiogenic properties of alendronate in combination with paclitaxel were also evaluated, testing conjugates in HUVEC (human umbilical vein endothelial cells). PTX and ALN in free form and conjugated, showed a inhibition of proliferation and migration of HUVEC and also, after 8 hours of incubation, a reduction of capillary structures formation by 50-60%. In vivo an improve of pharmacokinetic profile compared to free drug was found, which was confirmed by an increase of half-life. In addition tumor activity studies in vivo were performed by inoculating both 4T1 cells (syngeneic mouse) and MDA-MB-231 (xenograft mouse) in tibia mice. These studies shown that PTX-PEG-ALN conjugate has a greater antitumor effect compared to PTX alone at the same dose. This enhanced antitumor activity was attributed to preferential accumulation of the conjugate in the tumor tissue, as confirmed by the analysis of distribution in the body, performed with FITC-labeled conjugates. Furthermore, treatment with the conjugate did not result in weight loss or death of the animal in contrast to what was found for mice treated with paclitaxel and paclitaxel in combination with alendronate. This type of bone targeting was studied with the prospects of using these derivatives PEG-alendronate in order to target growth factor for the preparation of scaffolds in the area of bone tissue reconstruction.

Il Drug Delivery è un campo in rapida evoluzione a cui si fa sempre più ricorso per massimizzare le potenzialità e la sicurezza degli agenti terapeutici. Il progetto di questa tesi è focalizzato sullo sviluppo e la caratterizzazione di sistemi di veicolazione di molecole biologicamente attive. Sono stati studiati sistemi di drug delivery (DDSs) basati sui carrier polimerici. Fra i vantaggi di questi sistemi è possibile elencare un aumentata solubilità, una prolungata esposizione del farmaco, una protezione dalla degradazione enzimatica un rilascio controllato del principio attivo e un accumulo preferenziale nel tessuto malato. I DDSs qui sviluppati sono stati prima testati nell’ambito della terapia antitumorale dove sono importanti le problematiche di delivery, rilascio controllato e targeting. Tuttavia questi potranno essere applicati anche al campo dell’ingegneria tissutale dove le medesime problematiche sono di basilare importanza per lo sviluppo di scaffold per cellule in grado di rilasciare fattori di crescita. Questo lavoro si è articolato in due studi. Il primo studio si è focalizzato sulla comparazione del comportamento biologico (citotossicità in vitro, uptake cellulare e farmacocinetiche in vivo) di cinque coniugati polimero-farmaco diversificati per il tipo di carrier polimerico e contenenti epirubicina come farmaco antitumorale modello, coniugato via legame amidico. I carrier presi in considerazione si distinguono in: polimeri nonbiodegradabili (poli-idrossipropilmetacrilamide (HPMA) sia con GFLG come spaziatore degradabile che GG come spaziatore stabile, e polietilenglicole (PEG)) e polimeri biodegradabili (acido poliglutammico (PGA) e acido polisialico (PSA)). Dopo essere stati caratterizzati dal punto di vista della purezza e della stabilità in condizioni fisiologiche, tutti i coniugati sono stati testati in vitro su cellule MCF-7 (cellule umane di adenocarcinoma al seno) e MCF-7/Dx (cellule umane di adenocarcinoma al seno con resistenza alle antracicline). Nelle cellule MCF-7, tutti i coniugati risultano relativamente non citotossici alle concentrazioni testate come ci si attendeva per il tipo di coniugati sintetizzati. Nel caso dei due coniugati biodegradabili è stata comunque osservata una certa attività citotossica (circa 40% di riduzione della vitalità alla concentrazione 1µM sia per acido polisialico che poliglutammico). PEG-Epi, HPMA-GFLG-Epi, HPMA-GG-Epi e PGA-Epi sono risultati inattivi anche verso le cellule resistenti alle antracicline, mentre il PSA-Epi alla concentrazione 1µM riduce del 30% la vitalità. Gli studi eseguiti con FACS in presenza di inibitori selettivi dei diversi meccanismi di endocitosi hanno permesso di capire che tutti i coniugati sono stati internalizzati attraverso endocitosi colesterolo-dipendente suggerendo quindi che l’uptake non è responsabile del diverso comportamento di citotossicità osservato. In fine, sono stati eseguiti studi farmacocinetici in vivo su topi Balb/c, attraverso i quali è stato dimostrato un significativo aumento del half-life dei coniugati rispetto al farmaco libero. Il secondo studio si è focalizzato sulla sintesi e caratterizzazione di coniugati polimerofarmaco direzionati basati sul PEG, con struttura dendrica ben definita, per la veicolazione del farmaco antitumorale paclitaxel (PTX). La conformazione del PEG dendrone offre la possibilità di ottenere una struttura chimica definita in termini di contenuto di farmaco e agente di targeting. Inoltre, è stato ipotizzato che sintetizzando un PEG dendrone eterobifunzionale, chiamato NH2-PEG-βGlu-(βGlu)2-(COOH)4, è possibile ottenere un coniugato con un alto grado di omogeneità che condiziona positivamente sia le proprietà di targeting sia l’attività. Il PEG eterobifunzionale permette la suddivisione della funzione di targeting da quella dell’attività attraverso il legame del paclitaxel e dell’alendronato alle due estremità del polimero. Una struttura così disegnata porta ad ottenere un coniugato anfifilico, date le caratteristiche idrofobiche del paclitaxel e quelle idrofiliche dell’alendronato. Inoltre, la separazione spaziale dei due farmaci, oltre ad offrire la possibilità di formare micelle, permette di mantenere tutte le molecole di alendronato esposte all’acqua e quindi immediatamente disponibili per il legame con i minerali di idrossiapatite dell’osso. Il paclitaxel è stato quindi coniugato via legame estereo, attraverso uno spaziatore succinico, ad una estremità del PEG mentre all’estremità opposta sono state legate quattro molecole di alendronato, per ottenere un targeting mirato all’osso. I coniugati possono, inoltre, accumularsi nel tumore per targeting passivo, in quanto il loro elevato peso molecolare ne permette l’accumulano nel tumorale grazie ad una extravasazione preferenziale nei tumori solidi per l’elevata permeabilità dei vasi sanguigni in questa sede, noto anche come effetto EPR (Enhanced Permeability and Retention). Tutti i coniugati sintetizzati sono stati caratterizzati dal punto di vista della quantità di PTX e ALN legati, della purezza e della stabilità in condizioni fisiologiche. Tali coniugati hanno dimostrato una degradazione del 50% dopo 1h di incubazione a pH 7.4 e in plasma confermando così che il tipo di legame permette il rilascio del farmaco in condizioni fisiologiche. I coniugati a base di PTX e ALN hanno inoltre dimostrato di avere elevata affinità per l’idrossiapatite, in vitro, permettendo così di confermare le potenzialità dell’alendronato come agente direzionante, e attività citotossica simile a quella del farmaco libero o in combinazione con alendronato in cellule 4T1 (cellule murine di adenocarcinoma mammario), MDA-MB-231 (cellule umane di adenocarcinoma mammario) e in PC3 (cellule umane di adenocarcinoma prostatico). Sono state inoltre valutate le proprietà anti-angiogeniche dell’ alendronato in combinazione con il paclitaxel testando i coniugati in HUVEC (cellule endoteliali umane del cordone ombelicale). PTX e ALN in forma libera e i coniugati hanno mostrato inibizione sia della proliferazione che della migrazione di tali cellule, inoltre dopo 8 ore di incubazione, è stata osservata riduzione della formazione di strutture capillari del 50-60%. In vivo è stato riscontrato un miglioramento del profilo farmacocinetico, comparato a quello del farmaco libero, confermato da un incremento dell’ half life. Sono stati eseguiti, inoltre, studi di valutazione dell’attività tumorale in vivo, inoculando sia cellule 4T1 (syngeneic mouse) sia MDA-MB-231 (xenograft mouse) a livello tibiale nel topo. Questi studi hanno dimostrato che il coniugato PTX-PEG-ALN presenta un effetto antitumorale superiore comparato a quello del PTX da solo alla stessa dose. Questa migliore attività antitumorale è stata attribuita all’accumulo preferenziale del coniugato nel tessuto tumorale, come confermato dall’analisi di distribuzione nel corpo eseguita con gli stessi coniugati ma fluoresceinati. Inoltre, il trattamento con il coniugato non ha comportato né perdita di peso né mortalità dell’animale diversamente da quanto riscontrato per i topi trattati con paclitaxel e paclitaxel in combinazione con alendronato. Questo tipo di targeting all’osso è stato studiato con le prospettive di impiegare questi derivati PEG-Alendronato al fine di veicolare agenti di crescita per la costituzione di scaffold nell’area di ricostruzione del tessuto osseo.